Özet

IL-8瞬时转化的小鼠模型<em>体内</em>长期监测炎症反应

Published: July 07, 2017
doi:

Özet

这里描述的方法允许通过非侵入性生物发光成像(BLI)在小鼠肺中IL-8启动子依赖性炎症激活的可视化。荧光素酶报告基因构建体的交付时间可以将相同的动物多次进行BLI多至两个月。

Abstract

气道炎症通常与细菌感染相关,代表肺部疾病的主要决定因素。各种因素的促炎能力的体内测定是具有挑战性的,并且需要终端程序,例如支气管肺泡灌洗和用于原位分析的肺的去除,排除了在同一只小鼠中的纵向可视化。在这里,通过在异源IL-8牛启动子的控制下,表达荧光素酶报告基因的瞬时转基因小鼠气管内滴注铜绿假单胞菌培养上清(SN)诱导肺部炎症。通过滴注后2.5至48小时的时间范围内的体内生物发光图像(BLI)分析来监测肺中的荧光素酶表达。该过程可在2-3个月内重复多次,从而允许评估同一小鼠的炎症反应需要终止动物。这种方法允许实时监测在肺中起作用的促炎症因子和抗炎因子,并且似乎适合于功能和药理学研究。

Introduction

慢性肺部疾病,如哮喘,慢性阻塞性肺疾病(COPD),囊性纤维化(CF)和支气管扩张,其特征在于气道炎症。气道炎症的特征在于水肿,细胞浸润,T淋巴细胞和肥大细胞活化,气道分泌增加和胶原沉积过多。 CF是多系统疾病,其主要死因和发病原因是肺细菌感染与肺部恶化加重。肺功能的下降预测显着较差的结果1,2,3,4

呼吸道的炎症状态通常通过评估在炎症过程中引发的免疫标记来观察,所述免疫标记来源于下呼吸道和上呼吸道,例如痰液,其提供可变的resULTS。支气管镜也进行5 。鼠模型是研究以气道炎症为特征的疾病的发病机理和进展的有价值的工具,并且尚未确定有效的治疗或治疗方法。肺部感染和炎症的动物模型已被用于研究哮喘和宿主 – 病原体相互作用,包括模拟人类病症的化学物质的作用( 例如,香烟烟雾暴露,LPS,弹性蛋白酶,卵白蛋白,poly I:C ,作为以及上述的组合) 6 。炎症相关参数的测量需要牺牲动物,因为需要侵入性方法来测量诸如细菌负荷,肺中的细胞因子和收集的支气管肺泡灌洗液(BAL)液体等因素。此外,通常需要进行组织学检查。获得关于炎症反应动力学的信息的可能性需要使用numerous小鼠因此,在技术,道德,经济和运营基础上,无需牺牲动物就可以获得这种信息的技术是有价值的。

IL-8是炎症过程中的重要参与者,将白细胞募集到发炎组织。它代表了炎症途径激活研究的分子读数。 MIP-2和KC可以是小鼠中人IL-8的功能同源物。小鼠仅表达一种潜在的IL-8受体,即人CXCR2,7,8的同系物,但它们能够调节驱动报告基因的异源IL-8基因启动子。在观察到牛IL-8启动子/荧光素酶报告基因构建体可以在小鼠中反式激活之后,最近开发了肺炎症鼠模型。该功能允许利用生物发光成像(BLI)监测生活中的炎症反应小数9

该模型已经适应于研究由细菌外源产物( 例如 LPS或细菌株释放的产物)或TNFα10,11引起的炎症。药物发现过程的重点是开发和优化可以治疗肺部疾病如CF,哮喘和COPD的新旧抗炎分子。这些新的化学实体必须在可以与特定临床表型相关联的动物模型中快速方便地进行测试,以便于智能临床试验的设计。

Protocol

描述的所有动物实验由维罗纳大学实验研究服务部门间动物实验室内动物福利委员会批准,并遵守欧洲指令2010/63 UE,意大利D.Lgs 26/2014和修订版“实验动物护理和使用指南”,华盛顿特区:国家科学院出版社,1996年。该方案和实验由美国国家卫生研究院(n 273/15)批准。动物可以自由进入标准的啮齿动物食物和软化的自来水,并且适应环境至少5天到当地的生殖条件(室温:20-24℃;相对湿度:40-70?…

Representative Results

将bIL-8-Luc瞬时转基因小鼠模型用于体内监测用含有分泌的毒力因子的浓缩细菌上清液(30x)攻击的小鼠的肺部炎症。诱导的炎症反应可通过体内成像检测,因为BLI信号的增加。尽管BLI信号在5和24小时之间达到最高峰,并且在48小时仍然是可检测的,但在滴注后2.5小时可清楚地检测出促炎活性。 <img alt="图3" class="xfig…

Discussion

在以前的工作11中 ,显示了bIL-8-Luc依赖性BLI和BAL标记之间的对比。它依赖于小鼠品系12的敏感程度差异。因此,bIL-8-Luc模型首次应用于不同的小鼠品系需要对BLI和更标准化的炎症标记物进行初步的炎症反应研究。

小鼠转染引起轻度肺部炎症和bIL-8-Luc的活化,这可以通过BLI在DNA注射后3〜4天可以检测到( 图4 )。 1周后完全消失<su…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到意大利囊性纤维化基金会项目FFC#18/2013,FFC#29/2015和意大利囊性纤维变性联盟的支持,该联盟通过威尼托分公​​司 – 协奏曲Veneta Lotta控制Fibrosi Cistica Onlus。

Materials

FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo Imaging System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 750 FAST Perkin Elmer Inc. NEV10001EX Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC Harlan Laboratories Italy Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector Promega E1751 Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent Polyplus transfection 201B-001G The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1g Perkin Elmer Inc. 122796 Protect from light, store at -20 °C
Living Image software Caliper Life Sciences, Experimental Builder
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit Bio-Rad Laboratories M60-009RDPD Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8 Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5ml Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 ml (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1ml Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

Referanslar

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