A unidade de inalação aqui descritos possam gerar, de amostra para a caracterização, e uniformemente depositar um aerossol da droga nos pulmões de roedores. Isto permite a determinação de pré-clínica da eficácia e segurança das doses de medicamentos depositados nos pulmões; dados fundamentais que permitem o desenvolvimento de medicamentos inalados clínica.
doenças respiratórias obstrutivas como asma e doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) são actualmente tratadas por drogas anti-inflamatórias e broncodilatadores inalados. Apesar da disponibilidade de tratamentos múltiplos, ambas as doenças estão crescendo preocupações de saúde pública. A maioria dos doentes com asma são bem controlados em terapias de inalação correntes, mas um número substancial de pacientes com asma grave não são. A asma afeta cerca de 300 milhões de pessoas no mundo e aproximadamente 20 por cento têm uma forma grave da doença. Em contraste com a asma, existem poucas terapias eficazes para a DPOC. Estima-se que 10% da população tem DPOC e a tendência das taxas de mortalidade está aumentando para a DPOC, enquanto diminui para outras doenças graves. Embora desenvolvimento de drogas para entrega inalado é um desafio, a unidade de inalação apenas de nariz permite a entrega directa de novos fármacos para o pulmão de roedores para os estudos de eficácia e segurança / toxicologia pré-clínicos. entrega da droga inaladatem múltiplas vantagens para doenças respiratórias, em que a alta concentração no pulmão melhora a eficácia e minimiza os efeitos secundários sistémicos. corticóides e broncodilatadores inalados beneficiar destas vantagens e entrega inalado pode também realizar potencial para futuras terapias biológicas. A unidade de inalação aqui descritos possam gerar, de amostra para a caracterização, e uniformemente depositar um aerossol da droga nos pulmões de roedores. Isto permite a determinação de pré-clínica da eficácia e segurança das doses de medicamentos depositados nos pulmões de roedores, os dados-chave necessária antes de se iniciar o desenvolvimento clínico.
Há muitas vantagens para administração por inalação de medicamentos para o tratamento de doença respiratória. entrega inalado aplica-se o agente terapêutico directamente ao local de acção, os pulmões. Uma concentração local elevada do fármaco nos pulmões oferece uma vantagem significativa que minimiza a dose e a exposição sistémica, e maximiza a eficácia. Esta é uma vantagem importante de que podem aumentar grandemente o índice terapêutico (TI, proporção de dose de droga que provoca um efeito secundário sobre a dose de medicamento que fornece eficácia) de um fármaco. Inalados β agonistas P2-adrenérgicos, os corticosteróides e as drogas anti-colinérgicos provaram ser eficazes na melhoria da função pulmonar em doentes com asma e DPOC, enquanto minimiza os efeitos secundários sistémicos (taquicardia, imunossupressão, e prisão de ventre) observados quando estes fármacos são tomados por via oral. Novas classes de drogas (por exemplo, inibidores de PDE4 e inibidores de BTK 1 2) têm recentementeprovaram ser eficazes na melhoria da função pulmonar em modelos pré-clínicos de doenças animais mas, semelhantes a agonistas? 2, corticosterdes, e fármacos anti-colinérgicos, sofrem de efeitos secundários sistémicos que podem ser minimizadas por entrega inalado. Devido ao custo adicional de desenvolvimento de drogas orais inalados vs, uma formulação de inalado só deve ser considerada para indicações respiratórias após administração oral / sistémica bem sucedida revela limitador de dose de efeitos secundários sistémicos com base no mecanismo.
Pré-clínico, os compostos inalados são optimizados para aumentar a TI, que requer eficácia in vivo e efeitos colaterais medições. Inicialmente estas medidas podem ser feitas em ensaios separados, geralmente uma medição topicamente entregue eficácia e uma medição de efeitos colaterais sistemicamente entregue, mas para comparar verdadeiramente compostos, eficácia e efeitos secundários deve ser medido nos mesmos animais após administração inalados. Isto requer estudos de dose / resposta que achieve composto suficiente administrado aos pulmões para induzir um efeito colateral mensurável. A única maneira actualmente para distribuir uniformemente grandes doses de medicamento para dentro dos pulmões de vários animais pequenos ao mesmo tempo é apenas de nariz inalação 3, 4, 5. Os pontos fortes e fracos de diferentes técnicas de exposição de inalação foram recentemente revisto 6, 7, 8. O equipamento especializado e uma grande quantidade de composto de ensaio (quantidades em gramas) são necessários para o nariz apenas de entrega de droga inalada, mas a prova de conceito estudos pode ser possível por outros meios.
Quando a quantidade de fármaco é limitada (mg quantidades), métodos de administração directa são uma opção, mas todos sofrem de deposição não homogénea, com mais droga concentrada ao longo das vias aéreas centrais e menos bem representados no parênquima / alveolarregiões 3, 4, 5. A dose eficaz entregue por instilação directa é sempre mais elevado e nunca podem ser directamente comparados para doses inaladas 4. Métodos de instilação directa, incluindo intranasal 9, intratraqueal líquido 10, 11 e pulverização instilação 12, ou por insuflação de pó seco 13, 14 pode ser utilizado como uma ferramenta de rastreio para determinar o intervalo de dose aproximada para estudos de inalação pelo nariz apenas mais tarde, ou para determinar o Classificação de eficácia / toxicidade por uma série de medicamentos semelhantes estruturalmente 15. Devido ao padrão de deposição das vias aéreas centrais, métodos de administração directa pode ser mais útil para determinar os efeitos dos compostos que actuam sobre as vias respiratórias centrais (broncodilatadores ou inibidores dos mastócitos) do que in o pulmão periférica (anti-inflamatórios).
Ao contrário dos seres humanos, que pode inalar uma dose de aerossol substancial concentrado a partir de um inalador de uma única respiração profunda, a geração contínua de um respirável (0,5-5? M de diâmetro aerodinâmico médio de massa, MMAD) de aerossol, durante até uma hora, é necessário para depositar uma dose eficaz da droga para os pulmões de um roedor com respiração espontânea em um sistema de inalação apenas de nariz 16. Geradores de aerossol (nebulizador de jacto ou a alimentação de pó Wright 17) que pode produzir continuamente o tamanho de partícula de aerossol necessária e concentração para estudos de inalação pelo nariz apenas não são muito eficientes para a geração de alta qualidade aerossóis (respiráveis). As taxas de alimentação de drogas a estes geradores de aerossóis para potente (IC 50 pM a nM em ensaios baseados em células funcionais) compostos são comumente no intervalo de 1 a 10 mg / intervalo de minutos e, geralmente, menos do que 1% do que o aerossol da droga torna-o para a zona de respiração dos animais(Figura 1). Muitas das partículas geradas são demasiado grande (> 5 um) para entrar nos pulmões e são removidos por um classificador de aerossol (um pré-separador ou ciclone com um ponto de corte de 5? M) para evitar uma grande dose de droga no nariz. Somando-se a ineficiência dos sistemas de inalao pelo nariz apenas é o pequeno intervalo de tamanho de partícula (0,5 a 5 um MMAD) de partículas respiráveis. Muitas das partículas de aerossol inferior a 0,5 um são exalados (como o fumo do cigarro) e não depositada nos pulmões 18. Além disso, muitas das partículas de aerossol "maior" (~ 5 m) de depósito no nariz são absorvidos ou transportado por depuração mucociliar em direcção a parte posterior da garganta onde eles são engolidas para o estômago 19. Ao utilizar a inalação só de nariz, a dose depositada no nariz é sempre maior do que a dose depositada nos pulmões e a dose nasal pode contribuir para a exposição sistémica e efeitos secundários 20. Inerentemente, Dru inaladog doses são pequenos (na gama de microgramas) minimizar qualquer potencial efeito colateral sistémica de fármaco absorvido pelo nasal, pulmonar, ou tecidos gastrointestinais. Mesmo quando o tamanho de partícula do aerossol fornecida aos animais está na gama respirel, uma média de apenas 4% das partículas de aerossol que tornam a zona de respiração do depósito de animais nos pulmões. geradores de aerossol mais eficientes estão disponíveis, mas o nebulizador de jacto e alimentação de pó são Wright inigualável para a sua capacidade de produzir aerossóis contínuas a partir de diversas formulações de pós secos e líquidos, respectivamente.
Aerossol respirável a partir do pré-separador passa para a unidade de inalação de exposição somente de nariz 21 que se baseia em um fluxo passado a concepção de ponta 22. A unidade de inalação tem 3 camadas (apenas duas camadas são mostradas na Figura 1) e cada camada contém 10 portas de exposição para animais e amostragem de aerossol. Os portos estão localizados perifericamente ao redor do ceplenum aerossol ntral. ratinhos conscientes são colocadas em suportes de retenção de vidro (6 polegadas de comprimento por 1,2 polegadas de diâmetro) e respirar o conteúdo de aerossol da unidade de inalação. Os ratos não são aclimatados aos dispositivos de retenção 23. A experiência anterior demonstrou que os ratinhos tolerar contenção tubo de menos de uma hora de duração de modo semelhante, com ou sem adaptação 2.
A unidade de inalação destina-se a entregar aerossóis de drogas directamente nos pulmões dos animais, evitando a exposição aos operadores. A potência / toxicidade dessas drogas é geralmente controles de segurança de engenharia desconhecidos e múltiplas são usados para evitar a exposição aos operadores. Os operadores devem sempre usar equipamento de proteção individual (luvas, casacos de laboratório, respiradores e óculos de segurança). A câmara de pressão exterior da unidade de inalação está sob pressão negativa em todos os momentos durante a operação, permitindo a remoção segura do único ou grupos de animais without desligar o gerador de aerossol. A unidade de inalação também está contido num invólucro secundário mantido a uma pressão negativa por uma abertura de escape no tecto para evitar qualquer fuga de aerossol para dentro do quarto, no caso de mau funcionamento. Todo o ar efluente do sistema de inalação é filtrado por um filtro HEPA antes da libertação para o ambiente. O sistema de exposição só de nariz usada neste manuscrito foi comprado de um único fornecedor (ver Tabela Suplementar de Materiais).
Um sistema de inalação apenas de nariz e o seu funcionamento para entregar aerossóis farmacêuticos para os pulmões de roedores tem sido descrita. Imobilizar animais em suportes só de nariz é um método vulgarmente utilizado para a exposição dos animais ao material transportado pelo ar. Uma experiência foi conduzida demonstrando o broncodilatador anticolingico brometo de ipratrópio 34 pode inverter potentemente metacolina broncoconstrição induzida quando administradas por inalação só de nariz para ratinhos com um ED 50 de 0,1 g / kg a dose depositada. Um aumento superior a 10 vezes na dose eficaz de ipratrópio foi necessário para broncodilatação seguinte entrega intratraqueal (ED50 intratraqueal = 1,3 ug / kg, dados não mostrados) de entrega. Isto é devido ao padrão de deposição não homogénea de droga nos pulmões produzidos por doseamento intratraqueal 3, 5, 10. 10 vezes e uma maior dose eficazdiferenciais entre as técnicas de doseamento intratraqueal inalados e para outras drogas têm sido observados anteriormente por outros 4.
O padrão de deposição não homogénea de droga nos pulmões produzidos por doseamento intratraqueal também retarda a absorção da droga pelo pulmão 35, diminuindo a taxa à qual o fármaco entra na circulação sistémica e diminuindo a probabilidade de ver os efeitos secundários sistémicos. Portanto, para optimizar a segurança / eficácia (índice terapêutico) 36 de novos medicamentos inalados, nariz entrega única de inalação deve ser usado. deposição intratraqueal vai dar uma estimativa imprecisa da TI, gerando erroneamente altas doses eficazes em doses baixas do pulmão e para a circulação sistémica.
À medida que novos medicamentos entregues pela via inalada são desenvolvidos, que é essencial para traduzir de forma adequada a dose de droga eficaz a partir de estudos pré-clínicos de eficácia para prever uma efdose humana ficacious para ensaios clínicos. A morte infame de Tusko o elefante 37 é normalmente referido na literatura para lembrar-nos usar o dimensionamento alométrica para prever as doses de drogas interespécies e que doses entre espécies de drogas não deve ser linearmente extrapolado na base de uma comparação simples das massas corporais. É comum a utilização de uma abordagem alométrico com um expoente b alométrica de 0,67 para prever as doses de drogas em humanos a partir de estudos pré-clínicos de eficácia 38. Utilizando o rato inalado ED90 de 0,9 ug / kg para o ipratrópio, um expoente alométrico de 0,67, uma massa corporal do rato de 0,03 kg, e uma massa corporal humano de 60 kg; um ED humana estimada 90 de 0,07 ug / kg ((0,9 * (0,03 / 60) (1-0,67) = 0,07) pode ser calculado como sendo a dose depositada humano prevista a partir nossos dados rato. Este valor predito é comparável ao humano real dose depositada eficaz de 0,26 ug / kg, a qual pode ser calculada a partir da entregue fazerSE de 40 ug 39 dividida pela massa do corpo humano de 60 kg multiplicada por uma fracção de inalação deposição pulmonar oral humana de 0,4 16 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Uma estimativa da dose depositada inalado humano eficaz também ajuda a planear as doses administradas utilizados em estudos de toxicologia por inalação necessárias para ensaios clínicos 40.
O equipamento especializado e grande quantidade de composto de teste (quantidades em gramas) necessária para o nariz apenas de entrega de droga inalada pode ser limitações significativas ao desenvolver a técnica de inalação apenas de nariz. Uma corrida de calibração sem animais presentes é necessário se for necessária uma dose específica para um estudo (geralmente toxicologia e não uma eficácia de dose / resposta), e esta calibração prazo exigirá mais droga para estar disponível. Esta execução de calibragem é necessário porque as propriedades físico-químicas de cada droga / formulação pode variar suficiente para afectar grandemente a dose depositadade droga nos pulmões. Optimização das taxas de alimentação de ar e da droga para o gerador de aerossol durante a calibração de execução é necessária para atingir um tamanho de partículas de aerossol e concentração para a dose específica necessária. Enquanto as taxas de ar e de alimentação gerador de aerossol de medicamentos sugeridos nos métodos são um ponto de partida razoável, existe um potencial para que uma formulação de fármaco específico será gerado um não-respiráveis (tamanho de partícula de> 5 mm) de aerossol. Na fase pré-clínica, muitas vezes não há medicamento suficiente disponível para fazer uma corrida de calibração e é impossível saber a priori quais doses (se houver) estão ficando para os pulmões. Além disso, a electricidade estática é produzido durante o processo de geração de aerossol e pode influenciar o tempo necessário para a concentração de aerossol para equilibrar. É importante aterrar corretamente o equipamento para minimizar carga estática. Outra opção para minimizar a electricidade estática é para adicionar humidade ao ar fornecido para a unidade de inalação, para aumentar a condutividade edissipar as cargas electrostáticas nas partículas 25. Humidificar o ar fornecido para o gerador de aerossol não é necessária para o conforto dos animais durante 1 h (<) sessões de dosagem curtas, mas deve ser considerado, se forem utilizados mais vezes de dosagem.
As drogas podem ser entregues para os pulmões de animais por inalação só de nariz passiva ou métodos de administração intratraqueal directas que são desviados de deposição da nasofaringe. Entrega inalação só de nariz é comumente utilizada no campo da toxicologia de inalação 41, mas é pouco usada no início do processo de descoberta de drogas. Uma equipa de investigação multidisciplinar é necessária para a realização de estudos de inalação pelo nariz apenas devido à: necessidade de grandes quantidades de droga, o conhecimento especializado necessário para formular, gerar e caracterizar os aerossóis; operar equipamento complexo, e medir a eficácia de drogas em modelos animais de doença respiratória. As técnicas de entrega aqui descritos são usados para desenvolver small molécula de droga inalada, mas no futuro pode ser aplicada para desenvolver agentes biológicos inalados 42, 43. Esperemos que os procedimentos e dicas documentados neste manuscrito facilitará nova descoberta de drogas e toxicologia pesquisadores pré-clínicos para adquirir as habilidades necessárias para entregar drogas para roedores por inalação de aerossóis.
The authors have nothing to disclose.
Nós reconhecemos: Dr. Thomas Budiman pelo TSE Systems GmbH por sua experiência e equipamento técnico personalização. John Fry (Battelle Inc.) e Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) para as suas discussões úteis. Tian Wu, Sam Mboggo, April Miller, e Sean Davis (Amgen) para obter ajuda com os experimentos.
Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |