Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l'analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.
Interrogazione funzione del gene in auto-rinnovamento o differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) offre una valida piattaforma per comprendere lo sviluppo umano e la dissezione dei meccanismi della malattia in un piatto. Per sfruttare al meglio questo potenziale applicazione richiede strumenti di genoma-editing efficiente per generare mutanti HPSC nei geni associati alla malattia, così come in vitro protocolli di differenziazione HPSC per la produzione di tipi di cellule malattie rilevante che ricapitolano da vicino le loro controparti in vivo. Una piattaforma genoma-editing efficiente per hPSCs chiamato iCRISPR è stata sviluppata attraverso targeting TALEN-mediata di una cassetta di espressione Cas9 nel locus AAVS1. Qui, i protocolli per la generazione di linee inducibili Cas9 HPSC utilizzando cellule coltivate in un mezzo chimicamente definito e una condizione priva di alimentazione sono descritti. Le procedure dettagliate per l'utilizzo del sistema di iCRISPR per knockout gene o precise alterazioni genetiche in hPSCs, sia attraverso non-omologa end che unisce (NHEJ) o tramite precise alterazioni nucleotidiche utilizzando un modello di riparazione di omologia-diretto (HDR), rispettivamente, sono inclusi. Questi procedimenti tecnici sono descrizioni di progettazione, produzione, e trasfezione di RNA guida CRISPR (gRNAs); la misurazione del tasso di mutazione CRISPR mediante saggi T7E1 o RFLP; e la creazione e la validazione delle linee mutanti clonali. Infine, le procedure di cronaca per la differenziazione HPSC in cellule beta-pancreatiche come glucosio-reattiva imitando in vivo sviluppo embrionale del pancreas. Combinando la tecnologia iCRISPR con differenziazione HPSC diretto permette l'esame sistematico della funzione del gene per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi di sviluppo e di malattia diabete pancreatico.
Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità di entrambi di auto-rinnovarsi e dare origine a tutti i derivati delle tre linee germinali embrionali. Essi forniscono una risorsa preziosa per la terapia di sostituzione cellulare e modellazione malattia servendo come una piattaforma unica di ricapitolare processi cellulari in un contesto di sviluppo umano. Sono anche una fonte di cellule sperimentali per scalabili, analisi high-throughput. Tuttavia, il progresso è stato limitato a causa di due sfide principali: la mancanza di strumenti di modifica genetica efficienti e la difficoltà di ricapitolare le complesse fasi di sviluppo embrionale in un piatto di cultura.
La modificazione genetica è uno strumento indispensabile per studiare la funzione del gene nello sviluppo normale e la malattia. Tuttavia, mentre genica classica mira approcci tramite ricombinazione omologa hanno dimostrato di essere un potente strumento per analizzare la funzione del gene in topo cellule staminali embrionali (mESCs) 1, questo approccioè stato estremamente inefficiente quando applicato hPSCs 2, 3. La recente adesione vivace di programmabili, nucleasi site-specific dalla natura a uso di laboratorio, tra cui nucleasi dita di zinco (ZFNs), trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) ei cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR associata (CAS) sistemi 4, significa che l'ingegneria del genoma è diventato un compito molto più facile in una vasta gamma di organismi e linee cellulari, tra cui in hPSCs. Questi strumenti di editing gene approfittare del fatto che nucleasi chimerici come l'endonucleasi Cas9 possono permettere tutta una serie di modificazioni genetiche inducendo rotture del doppio filamento (DSB) in punti precisi, innescando il meccanismo di riparazione del DNA endogeno per attivare o non omologa terminare l'adesione (NHEJ) o riparare omologia-diretto (HDR). Entrambi i meccanismi possono essere sfruttate per la manipolazione genetica inducendo either l'inserimento casuale e mutazioni per delezione (indels; via NHEJ), per creare frameshift mutazioni che annullano gli alleli del gene, o sostituzioni nucleotidiche precisi (via HDR), di ricapitolare le mutazioni del paziente per la modellazione malattia umana o per correggere una mutazione che causa la malattia per la terapia genica .
CRISPR / ingegneria del genoma Cas-mediata richiede due componenti: la costante di RNA-guida Cas9 endonucleasi necessaria per scissione del DNA e RNA variabile CRISPR (crRNA) e duplex trans-attivazione (tracrRNA) che specifica il riconoscimento DNA bersaglio. Il duplex crRNA / tracrRNA può essere sostituito con un unico chimerico guida RNA (gRNA), che sono stati trovati a lavorare in modo più efficiente 5, 6, 7. Mentre il sistema / Cas9 CRISPR è stato adattato per gli organismi più sperimentali e linee cellulari, la consegna e l'espressione di Cas9 e gRNA varia in modo significativo e deve essere ulteriormente ottimizzato per achivigilia editing efficiente genoma in molti sistemi, tra cui hPSCs 8. Una piattaforma efficiente genoma-editing, iCRISPR, è stata stabilita in hPSCs 5. In questo sistema, un approccio TALEN-mediata è stato usato per indirizzare entrambi gli alleli del AAVS1 "transgene porto sicuro locus" in trans, un allele con transattivatore inverso tetraciclina controllata (M2rtTA) e l'altra con un elemento di risposta tetraciclina (TRE ) che guida l'espressione di Cas9 (iCas9) nei hPSCs. Nelle linee clonali stabiliti (iCas9 hPSCs), Cas9 è altamente espresso con il trattamento doxiciclina. Nel frattempo, grazie alle sue dimensioni ridotte (100 nt), gRNAs singoli o multipli possono essere facilmente trasportati in iCas9 hPSCs con alta efficienza e possono dirigere Cas9 per la scissione site-specific, consentendo efficiente interruzione gene NHEJ mediata, così come HDR-mediata precise modifiche nucleotide in presenza di brevi modelli di donatori di DNA a singolo filamento (ssDNA). Il sistema può essere iCRISPRutilizzato per generare con successo un pannello di linee HPSC malattia mimando con biallelica (omozigote o eterozigote composto) o eterozigoti mutazioni perdita-di-funzione in importanti geni dello sviluppo 5, 9. Mentre un certo numero di gruppi hanno segnalato l'editing gene efficiente utilizzando CRISPR / Cas in hPSCs, il successo rimane limitata a un piccolo numero di laboratori tecnologicamente abili. La piattaforma iCRISPR offre una soluzione efficace e semplice per l'editing gene di routine da ricercatori di differenti livelli di abilità, ed è già stato utilizzato in una serie di studi pubblicati dal nostro gruppo e altri 9, 10, 11, 12. Questo approccio è stato ulteriormente esteso a tacere inducibile basata sull'espressione di dCas9-KRAB 13.
Insieme con il progresso nel genoma di modifica technologia, miglioramenti significativi sono stati raggiunti anche in HPSC manutenzione e la differenziazione diretto. Condizioni di coltura per hPSCs si sono evoluti da condizioni medie del mouse irradiato fibroblasti embrionali (IMEF) alimentatore-dipendenti a condizioni di libero-feeder sui componenti della matrice extracellulare definiti, e dalle formulazioni multimediali complessi di costituzione chimica definita 14. Tali miglioramenti hanno ridotto la variabilità in hPSCs a causa di differenze da lotto a lotto di componenti di ricambio Imef preparazione e siero eliminazione diretta, e quindi fornire un ambiente più riproducibile per la differenziazione HPSC. Nel frattempo, una migliore conoscenza delle vie di segnalazione che regolano lo sviluppo embrionale umano, così come le scoperte di high-throughput screening di droga, hanno portato ad un miglioramento dei protocolli di differenziazione 15, 16, 17, 18. Questi protocolli più strettamente imitano in vivo fasi di sviluppo e generare tipi di cellule che ricapitolano da vicino le loro controparti in vivo. Per HPSC differenziazione in lignaggio del pancreas, i protocolli iniziali imitato primi anni di sviluppo del pancreas relativamente bene, ma alla fine generato cellule beta polyhormonal che erano di fenotipi fetali immaturi e hanno risposto male alla stimolazione di glucosio. Recenti progressi 16, 17, 19, 20 hanno permesso per la generazione di cellule beta pancreatiche come glucosio-reattiva, che ci consentiranno di investigare eventi successivi, come la formazione e l'ulteriore maturazione delle cellule beta monohormonal.
Qui, abbiamo dettaglio l'applicazione delle linee genoma modificato per lo studio dello sviluppo del pancreas, combinando il sistema iCRISPR con la piattaforma HPSC basata in vitro la differenziazione verso pancr glucosio-reattivacellule beta-like eatic. Questo accoppiamento di potenti strumenti di editing del genoma con un miglioramento del protocollo di differenziazione HPSC non solo offre la velocità e la scala necessarie a soddisfare la crescente domanda per la convalida malattia causalità, ma consente anche di sofisticate manipolazioni genetiche per ulteriori indagini meccanicistici in controllo trascrizionale alla base dello sviluppo normale e la malattia 9 .
Considerazioni Tempo per la generazione di mutanti Lines
Anche se gli approcci più recenti basati su sistemi / Cas CRISPR per la modifica del genoma hanno portato a il targeting di successo, una piattaforma più efficace e universale sarebbe preferibile per i più grandi scala analisi della funzione del gene. La piattaforma iCRISPR offre un metodo rapido ed efficace per introdurre mutazioni a qualsiasi gene di interesse 5, 9. In primo luogo, il metodo di sintesi gRNA basato sulla PCR consente la produzione di centinaia di gRNAs in formato disposte in un giorno senza le fasi di clonazione in termini di tempo. In secondo luogo, con l'espressione Cas9 doxiciclina-inducibile in iCas9 hPSCs, il passo che coinvolge gRNA trasfezione richiede solo una minima quantità di lavoro, e, quindi, più gRNA esperimenti di targeting può essere condotta contemporaneamente. In terzo luogo, a causa della elevata Targeting efficienze ottenibili con il nostro sistema, l'analisi di ~ 24 – 48 colonie per gRNA transfettate dovrebbero essere sufficient stabilire monoallelic multiplo e linee mutanti biallelici per un singolo gene, anche se efficienze variano a seconda del locus bersaglio. Dal momento che è possibile per un individuo addestrato per raccogliere meccanicamente 384 colonie (lastre 4 x 96 pozzetti) in una sola seduta, che dovrebbe prendere ~ 4 ore sotto un microscopio da dissezione, un individuo addestrato può essere previsto per generare linee mutanti che interessano 12 geni all'interno 12 mesi. La generazione di mutanti snella HPSC in poco tempo permette l'analisi sistematica di una serie di fattori di trascrizione e / o componenti percorso di segnalazione che interagiscono tra di loro, che regolano il processo di sviluppo 9. Inoltre, il targeting efficiente gene multiplex apre anche la porta ad indagare le interazioni genetiche sottostanti tratti umani complessi.
Generazione di Precise modifiche genetiche
La derivazione di iPSCs-paziente specifici da facilmente accessibile tipo di cellule somatiche s e la differenziazione in tipi di cellule malattie rilevanti forniscono una grande opportunità per la validazione funzionale delle mutazioni associate alla malattia. Tuttavia, a causa della notevole variabilità genetica tra individui, confronti diretti tra iPSCs da pazienti e da donatori sani potrebbero non consentire di distinguere fenotipi di malattia da effetti di sfondo. Pertanto, è necessario generare iPSCs controllo isogeni correggendo la malattia mutazione torna alla sequenza wild-type o di introdurre mutazioni specifiche del paziente in una wild-type HPSC sfondo, come proposto da altri 25, 26. Oltre a (nulli) mutazioni perdita di funzione, si può ora analizzare con maggiore precisione i meccanismi della malattia attraverso l'introduzione di un paziente-specifici alterazioni di sequenza nel locus endogeno hPSCs, tra cui il paziente hypermorphic, hypomorphic, neomorphic, o dominante negativo mutazioni.
S copi "> modifica genetica Precise impiega HDR per la riparazione DSB in presenza di un modello di riparazione. Dal momento che è molto meno efficiente di riparazione del DNA NHEJ-mediata, un plasmide donatore contenente la specifica mutazione-paziente, una cassetta selezione dei farmaci, e braccia omologia è stato precedentemente utilizzato come modello di riparazione 2. Dopo la selezione della droga e la verifica della specifica mutazione-paziente, un secondo passo è generalmente necessario per rimuovere la cassetta di selezione della droga. Mentre i più diffusi sistemi di Cre-loxP e FLP-FRT lasciano dietro sequenza residua nel locus endogena, l'uso di piggyBac trasposone ha permesso la rimozione senza saldatura della cassetta di selezione droga 27. Più recentemente, i modelli ssDNA brevi hanno anche dimostrato di sostenere HDR efficiente con endonucleasi di DNA ingegnerizzati 28. Rispetto ad un plasmide donatore , ssDNA può essere sintetizzato direttamente aggira quindi il passo clonazione tempo. Qui, deve essereen dimostrato che, mediante co-trasfezione gRNA e un modello ssDNA per indurre riparazione omologia-diretto, iCRISPR può essere utilizzato per introdurre modifiche nucleotidiche specifiche con alta efficienza. Questo è fondamentale non solo per sezionare il ruolo dei nucleotidi essenziali all'interno proteine domini funzionali, ma anche per modellare malattia mutazioni umane e potenzialmente correggere queste mutazioni malattia-associato, per intervento terapeutico. A causa del gran numero di suscettibilità loci che sono ciascuno associato a più varianti di sequenza, modellando malattie complesse e multigenici come diabete è stata una sfida per i genetisti. Come la piattaforma iCRISPR è permissivo per la rapida generazione di una serie allelica o per il targeting canalizzabile gene, può facilitare la ricerca di più loci associata a malattia, singolarmente o in combinazione con sfondi isogenici.Targeting efficienze ed effetti fuori bersaglio
abbiamo trovato una buona correlazione tra la T7E1 e risultati del test RFLP e il numero di linee mutanti identificati mediante sequenziamento. Questo sottolinea l'importanza di eseguire questi test in parallelo con la creazione di linee clonali. Mentre le efficienze di targeting ottenuti possono variare a seconda delle loci genomici, nella maggior parte degli esperimenti singolo gene targeting, 20 – 60% dei cloni sono stati trovati con entrambi gli alleli mutati (compresi in-frame e frameshift mutazioni) 9. Nei casi in cui è stata eseguita multiplex gene targeting, triple cloni mutanti bialleliche con il 5-10% di efficienza sono stati ottenuti 5. ssDNA mediata HDR di diversi geni sono stati anche eseguiti per ottenere precise alterazioni genetiche, con le efficienze di ottenere omozigote knock-in cloni che vanno da 1 – 10% 5. Lavorare con CRISPR / Cas in hPSCs, eventuali mutazioni nei potenziali siti off-bersaglio che non condividono la stessa sequenza bersaglio gRNA devono ancora essere rilevatalass = "xref"> 5, 9, 12. Whole-sequenziamento del genoma eseguito in un recente studio ha anche omesso di individuare sostanziali mutazioni fuori bersaglio nelle linee clonali HPSC generata utilizzando CRISPR / Cas 29. Tuttavia, per ridurre al minimo qualsiasi potenziale effetto di confondimento fenotipi introdotte da mutazioni nei siti ad effetto fuori bersaglio, si consiglia di generare linee mutanti indipendenti utilizzando almeno due gRNAs indipendenti di targeting sequenze diverse all'interno dello stesso gene. fenotipi simili osservati in più linee generati utilizzando diverse gRNAs potrebbe principalmente escludere la possibilità che il fenotipo proviene da un effetto centra la porta.
Alimentatore-dipendente contro la cultura indipendente e targeting
I metodi tradizionali per la cultura HPSC coinvolgono il loro mantenimento e l'espansione su cellule feeder in supporti contenenti siero o sostituzione siero che include prod animaledotti, come albumina di siero bovino. cellule di alimentazione, siero, siero di sostituzione, e l'albumina contengono tutti complessi, componenti non definiti e mostrano una notevole variabilità dei lotti. L'adattamento alla condizione-alimentatore libero e chimica definita riduce in modo significativo gli sforzi per HPSC manutenzione e, soprattutto, aumenta la consistenza degli esperimenti di differenziazione. Allo stato attuale, ci sono pochi studi che descrivono le procedure di modifica del genoma su hPSCs coltivate in condizioni di coltura completamente definite 30. Abbiamo trovato maggiore CRISPR mira efficienza quando gRNA trasfezione e la deposizione clonale sono stati eseguiti in condizioni di assenza di alimentazione rispetto alle condizioni di coltura di alimentazione-dipendente. Noi crediamo che questo sia dovuto ad un aumento della sopravvivenza delle cellule dopo la trasfezione e semina cella singola per la formazione di colonie. Inoltre, cellule di alimentazione sono stati precedentemente dimostrato di sequestrare reagenti di trasfezione, riducendo così l'efficienza di trasfezione.
combinandoEditing Genome con differenziazione Regia
Precedente protocolli di differenziazione hanno prodotto solo una piccola frazione di cellule insulino-positive, la maggior parte dei quali erano polyhormonal e assomigliava cellule endocrine fetali 23. I recenti progressi ha permesso la differenziazione di hPSCs in cellule più mature glucosio-responsive beta-come 16, 17, 19, 20. Siamo in grado di routine ottenere cellule endoderma definitivo almeno il 75%, il 40% Pdx1 + NKX6.1 + progenitrici del pancreas, e circa il 20% NKX6.1 + CPEP + cellule beta-come il glucosio-reattiva utilizzando HUES8 hPSCs 9. In combinazione con il sistema di editing genoma iCRISPR, questo più robusto protocollo di differenziazione ha facilitato l'analisi dei fattori di trascrizione che sono cruciali per il progenitore e endocrini pancreatici fasi di differenziazione del pancreas. Questo renderàE 'possibile, in studi futuri, per esaminare un gran numero di geni-malattia candidato per la validazione funzionale e di indagine sui meccanismi che sono alla base del diabete 9.
Applicazioni o Direzioni future
Il nostro sistema di iCRISPR può facilitare la generazione di modifiche genomiche più complessi, come ad esempio la creazione di alleli giornalista attraverso gene targeting utilizzando lunga donatori modelli di DNA tag proteine di codifica o giornalisti fluorescenti 12 HDR-mediata. Abbiamo dimostrato che, a causa della elevata CRISPR di targeting efficienze raggiunte nel sistema, questo processo può essere eseguito in hPSCs, senza la necessità di selezionare ulteriori farmaci 12. Inoltre, gene multiplex mira può essere utilizzato per studiare le interazioni genetiche sottostante malattia umana complessa, come indicato nel nostro studio recente, che a nostro avviso è il primo esempio di tale lavoro 31. iCRISPR può essere utilizzato anche per capire il controllo normativo gene con la creazione di delezioni sia in RNA non codificanti del gene o in regioni regolatorie, come i promotori e stimolatori. Per generare in modo efficiente mutanti normativi utilizzando iCRISPR, gRNAs possono essere progettati per interrompere il sito di legame di una proteina di legame al DNA, compreso ma non limitato alla macchina di trascrizione basale o un fattore di trascrizione tessuto-specifica. ssDNA HDR modello mediata può essere utilizzato anche a mutare specifici siti di legame alle proteine. Infine, prevediamo che un'ulteriore ottimizzazione consentirebbe l'utilizzo della piattaforma iCRISPR in hPSCs per alte analisi genetiche di throughput di fenotipi pluripotenza o fenotipi di malattia in combinazione con un protocollo vitro differenziazione. Questi studi iCRISPR mediata possono consentire la più rapida identificazione dei candidati geni associati alla malattia e gli studi della loro rilevanza funzionale.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato in parte dal NIH / NIDDK (R01DK096239) e New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato NYSTEM dal Center for Stem Cell Biology della Sloan Kettering Institute.
Chemically defined medium (E8) | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included |
Truncated recombinant human form of vitronectin | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | 1X, animal origin free, recombinant enzyme |
G418 Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | Geneticin Selective Antibiotic |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | Puromycin Selective Antibiotic |
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) | Agilent Technologies | 600679 | PCR kit |
MEGAshortscript T7 Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1354 | |
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
Opti-MEM medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | QIAGEN | 69504 | Genomic DNA extraction kit |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
MCDB 131 medium | Thermo Fisher Scientific | 10372-019 | |
BLAR medium | Thermo Fisher Scientific | Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014) | |
L-glutamine supplement (GlutaMAX) | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | 144-55-8 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
BSA | LAMPIRE Biological Laboratories | 7500855 | Fatty acid free |
GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3 inhibitor |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Vitamin C |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog inhibitor |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | Retinoic acid |
LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP inhibitor |
IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt antagonist |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | |
TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC activator |
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5 inhibitor II |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
GSiXX | EMD Millipore | 565789 | Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Trolox | EMD Millipore | 648471 | Vitamin E analogue |
R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL receptor tyrosine kinase inhibitor |
24mm Transwell with insert | Corning Life Sciences | 3414 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | |
0.4 cm Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652081 | |
AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302L | |
Buffer 2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
Long oligonucleotide | Eton Bioscience or IDT | ||
SOX17 antibody | R&D Systems | AF1924 | 1: 500 |
FOXA2 antibody | Millipore | 07-633 | 1: 100 |
CXCR4-APC antibody | R&D Systems | FAB170A | 1: 25 |
PDX1 antibody | R&D Systems | AF2419 | 1: 500 |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12 | 1: 500 |
NKX2.2 antibody | DSHB | 74.5A5 | 1: 100 |
NEUROD1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1: 100 |
Insulin antibody | Dako | A0564 | 1: 2000 |
C-peptide antibody | DSHB | GN-ID4-c | 1: 2000 |
Glucagon antibody | Sigma-Aldrich | G2654 | 1: 1000 |