Özet

Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

Published: March 22, 2017
doi:

Özet

Expansão de células epiteliais humanas esofágicas pediátricos utilizando reprogramação condicional fornece investigadores com uma população específica no paciente de células que pode ser utilizada para engenharia construções esofágicas autólogo para implantação para tratar defeitos ou ferimentos e servir como um reservatório para ensaios de pesquisa de terapêuticos.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

engenharia de tecidos e esofagite eosinofílica (EoE) têm sido o foco de pesquisas em muitos laboratórios ao longo da última década. Defeitos congênitos, como a atresia de esôfago, são vistos em aproximadamente 1 em cada 4.000 nascidos vivos, o que resulta no desenvolvimento incompleto do esôfago levando à incapacidade de comer 1. A incidência e prevalência de EoE têm vindo a aumentar desde a identificação da entidade doença em 1993. A incidência de EoE variou entre 0,7 a 10 / 100.000 por pessoa-ano e a prevalência variou de 0,2-43 / 100.000 2. Uma nova abordagem cirúrgica atraente para o tratamento de longo intervalo atresia esofágica consiste na geração de construções de tecido para implante utilizando as células do próprio paciente. Estas células em conjunto com o andaime sintético irá gerar um construto autólogo que não exige imunossupressão. Alguns grupos já começaram a investigar os EUAe de células estaminais, como para engenharia de tecido esofágico 3, bem como a utilização de células epiteliais esofágicas nativas para repovoar a mucosa 4-7. Doenças que estão presentes no esófago do paciente pediátrico são muitas vezes difíceis de diagnosticar ou estudar sem intervenção. Além disso, utilizando modelos animais ou in vitro imortalizado modelos da linha celular para doenças pediátricas como EoE não abranger a patogênese da doença exata ou diferenças específicas dos pacientes 8. Portanto, a capacidade para o estudo do processo de doença de um paciente in vitro, a fim de identificar antigénios específicos de doença desencadeamento, avaliar os mecanismos subjacentes e investigar tratamentos com drogas seria novo e proporcionar aos médicos com informações que podem ajudar no tratamento do paciente.

Tem havido muitos tipos de células autólogas ou específicas do paciente que têm sido propostas para utilização em tissue engenharia e estudando patogênese da doença humana. No entanto, alguns destes tipos de células são limitados na sua capacidade para gerar células suficientes de um fenótipo específico para semear um grande andaime ou executar alto rendimento em estudos in vitro. O uso de células-tronco pluripotentes ou multipotentes tem sido o tema de muita discussão pesquisa, no entanto, limitações e insuficiências para o uso dessas células têm sido bem descrito 9. A utilização de células estaminais embrionárias humanas é altamente debatido e apresenta muitas questões éticas. Mais importante, estas células formam teratomas, que são semelhantes a um tumor, se eles não são diferenciados a partir de seu estado pluripotentes antes de entregar os em um hospedeiro vivo 10. Além disso, a utilização de células estaminais embrionárias não seria-específico do paciente e pode desencadear uma resposta alogénica e a necessidade para a supressão imune 10. Induzidas células-tronco pluripotentes (iPSCs) são células pluripotentes que podemser derivado a partir de células do próprio paciente. As células somáticas, tais como as células da pele, pode ser induzido para um estado pluripotente usando uma variedade de técnicas de integração e não-integrativos. Essas células, então, servir como uma fonte de células específicas do paciente para engenharia de tecidos ou de investigação da doença. A integração de material genético indesejado para estas células é uma preocupação muitos descreveram e mesmo sequências são completamente removidos iPSCs aparecem para conservar uma "memória" epigenética para o tipo de célula a partir da qual eles foram derivados 11. Estas células também irá formar teratomas in vivo, se não diferenciadas antes do transplante 11. Muitos protocolos de diferenciação têm sido investigados concentrando-se em linhagens epiteliais 12, 13, 14, no entanto, é muito importante notar que os tipos de células que resultam no final de diferenciação não são homogéneos e óomente possuir uma fracção do tipo de células de interesse. Isto resulta em baixo rendimento e a necessidade de purificar o tipo de célula desejado. Embora iPSCs são uma potencial fonte de células específicas do paciente, o processo para obter um tipo de células de interesse, quer para a engenharia de tecidos ou de investigação da doença é muito ineficiente.

Células epiteliais humanas foram isolados com sucesso a partir de uma variedade de ambos os tecidos doentes e não doentes no corpo humano, incluindo: 15 pulmão, de mama 16, 17 intestino delgado, cólon 18, 19 da bexiga e do esófago 20. É importante notar que as células humanas primárias têm um número finito de passagens em que o fenótipo é mantida 21, 22. Infelizmente, isto significa que o número de células necessário para a investigação da doença ou para semear um andaime engenhariapara o implante não pode ser alcançado. Portanto, as novas técnicas são necessários para expandir células do paciente enquanto ainda mantém um fenótipo epitelial. Reprogramação condicional de células epiteliais normais e cancerosos utilizando células alimentadoras e inibidor ROCHA foi descrito em 2012 por Liu et al. 2 3. Esta técnica foi utilizada para expandir células epiteliais cancerosas obtidos a partir de biópsias de câncer de próstata e de mama, utilizando células de alimentação irradiadas, inibidor ROCHA e médias reprogramação condicional. O objetivo era gerar células suficientes para ensaios in vitro, como o rastreio de drogas. Esta técnica é capaz de se expandir células epiteliais indefinidamente por "reprogramar" as células para um tronco ou progenitoras estado semelhante, que é altamente proliferativo. Foi demonstrado que estas células são não-tumorigénico e não possuem a capacidade para formar teratomas 23, 24. Além disso, nenhumanomalias cromossómicas ou manipulações genéticas estavam presentes após passaging estas células em cultura usando esta técnica 23, 24. Mais importante ainda, essas células só são capazes de se diferenciar em células do tipo nativo de interesse. Portanto, esta técnica oferece um grande reservatório de células epiteliais específicos do paciente para investigação da doença ou engenharia de tecidos sem a necessidade de imortalização.

A obtenção de tecido epitelial de um órgão específico, a fim de estudar processos de doença é muitas vezes limitada e nem sempre é possível, devido ao risco de paciente. Para os pacientes que sofrem de doença ou defeitos esofágico, recuperação endoscópica biópsia é uma abordagem minimamente invasiva para a obtenção de tecido epitelial que podem ser dissociados e condicionalmente reprogramadas de modo a proporcionar uma fonte de células indefinida que é específico para a mucosa do esófago que do paciente. Isso, então, permite estudos in vitrodas células epiteliais para avaliar os processos de doença e tela para potenciais agentes terapêuticos. Um processo de doença que poderiam beneficiar grandemente de esta abordagem é esofagite eosinofílica, que tem sido descrita como doença alérgica do esófago 8. Testes de alergia, bem como abordagens terapêuticas poderiam ser avaliada in vitro utilizando as próprias células epiteliais do paciente e estes dados podem então ser transmitida para o médico assistente para desenvolver planos de tratamento individualizado. A técnica de reprogramação condicional em conjunto com a obtenção de biópsias endoscópicas de pacientes pediátricos oferece a capacidade de expandir as células epiteliais do esôfago normais por tempo indeterminado a partir de qualquer paciente. Esta fonte de células poderiam, portanto, ser agrupado em conjunto com andaimes natural ou sintética para fornecer uma opção cirúrgica específica para cada paciente por defeitos, doença ou trauma. Ter um número de celular por tempo indeterminado ajudaria engenharia construções de esôfago que possuem uma completamente reseededlúmen com células epiteliais esofágicas, a fim de ajudar a facilitar a regeneração dos tipos de células restantes.

Protocol

biópsias esofágicas foram obtidos após consentimento informado foi obtido dos pais / responsáveis ​​dos pacientes pediátricos e de acordo com a placa de revisão institucional (IRB # 13-094). 1. esterilização de instrumentos e gelatina Solution forceps autoclave, lâminas de barbear e tesouras antes de manusear do tecido para evitar a contaminação. Para fazer 200 ml de solução de gelatina a 0,1%, combinar 200 mL de água destilada com 0,2 g de gelatina. Autoclave e fresco ante…

Representative Results

Um resumo das principais etapas isolar células epiteliais do esôfago de biópsias de pacientes estão resumidos na Figura 1. As colónias de células epiteliais vai formar em cerca de 4-5 dias e vai ser rodeado por células de alimentação de fibroblastos (Figura 2A). À medida que essas colônias expandir eles vão fundir-se com outras colónias para formar grandes colônias (Figura 2B). Uma vez que as culturas se tornaram 70% conflu…

Discussion

Os passos mais importantes, a fim de isolar e expandir células epiteliais esofágicas a partir de biópsias de pacientes são: 1) dissociação adequadamente tecido de biopsia com a morte celular mínima; 2) assegurar ROCHA inibidor é adicionado ao meio de cultura de células em cada mudança de meio; 3) Não use mais células alimentadoras do que o recomendado; 4) manter uma cultura asséptica limpo; e 5) células de passagem apenas antes de atingir a confluência.

Devido às diferenças …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to acknowledge Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.

Materials

Primocin InVivogen ant-pm2
Isopentane Sigma Aldrich 277258-1L
Gelatin From Porcine Skin Sigma Aldrich G1890-100G
DMEM Thermofisher Scientific 11965092
Cryomold TissueTek 4565
Cryomatrix OCT Thermofisher Scientific 6769006
15ml Conical Tubes Denville Scientific C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium Thermofisher Scientific 10724011
Penicillin Streptomycin Thermofisher Scientific 15140122
Glutamax Thermofisher Scientific 35050061
Insulin Solution Sigma Aldrich I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632) Fisher Scientific 125410
F-12 Medium  Thermofisher Scientific 11765054
Fetal Bovine Serum Denville Scientific FB5001
Dispase Thermofisher Scientific 17105041
0.05% Trypsin-EDTA Thermofisher Scientific 25300062
0.25% Trypsin-EDTA Thermofisher Scientific 25200072
100mm Dishes Denville Scientific T1110-20
150mm Dishes Denville Scientific T1115
50ml Conicals Denville Scientific   C1062-9 
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher Scientific BP2944-100
5ml Pipettes Fisher Scientific 1367811D
10ml Pipettes Fisher Scientific 1367811E
25ml Pipettes Fisher Scientific 1367811
9" Pasteur Pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
NIH 3T3 Cells ATCC CRL1658

Referanslar

  1. Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
  2. Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
  3. Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
  4. Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the ‘hybrid construct’ approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
  5. Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
  6. Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
  7. Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
  8. Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
  9. Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
  10. Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
  11. Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
  12. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
  13. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
  14. Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
  15. Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
  16. Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
  17. Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
  18. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
  19. Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
  20. Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
  21. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
  22. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. . Molecular Cell Biology. , (2000).
  23. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
  24. Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
  25. Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
  26. Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Jensen, T. J., Foster, C., Sayej, W., Finck, C. M. Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation. J. Vis. Exp. (121), e55243, doi:10.3791/55243 (2017).

View Video