Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.
De release van extracellulaire blaasjes (EV's), met inbegrip van kleine-endosomale afgeleid exosomes (Exos, diameter <100 nm) en een grote plasma-membraan afgeleid microvesicles (MV's, diameter> 100 nm) is een fundamenteel cellulair proces dat zich voordoet in alle levende cellen. Deze vesicles transporteiwitten, lipiden en nucleïnezuren die specifiek zijn voor de oorspronkelijke cel en in vitro studies hebben het belang benadrukt als mediatoren van intercellulaire communicatie. EV met succes geïsoleerd uit verschillende lichaamsvloeistoffen en vooral EV in bloed werden geïdentificeerd als veelbelovend biomarkers voor kanker of infectieziekten. Om de studie van MV subpopulaties in bloed laten presenteren we een protocol voor de gestandaardiseerde isolatie en karakterisering van MV's uit perifere bloedmonsters. MVs gepelleteerd van EDTA-anti-gecoaguleerd plasma-monsters door differentiële centrifugatie en typisch bezitten een diameter van 100-600 nm. Door hun grotere omvang, kunnen zegemakkelijk worden onderzocht door stromingscytometrie, een techniek die routinematig wordt gebruikt in de klinische diagnostiek en in de meeste laboratoria. Verschillende voorbeelden voor kwaliteitscontrole analyses van de geïsoleerde MV krijgt en markers die kunnen worden gebruikt voor het onderscheiden van verschillende MV subpopulaties in bloed wordt gepresenteerd.
In de laatste jaren veel in vitro studies hebben aangetoond dat extracellulaire blaasjes (EV's) een belangrijke rol in intercellulaire communicatie spelen. Levende cellen voortdurend werpen blaasjes die verschillen in grootte, inhoud en biogenese. De best bestudeerde EV's zijn exosomes die afkomstig zijn van het endosomale systeem waar ze als intraluminale blaasjes in multivesiculaire lichamen worden opgeslagen. Zodra deze zekering door het plasmamembraan, worden de vesikels opgenomen uitgebracht exosomes (Exos, diameter 30-100 nm 1). Een tweede populatie van EV, die steeds meer aandacht in de afgelopen jaren heeft opgedaan zijn groot microvesicles (MV's, een diameter van 100 – 1000 nm) die rechtstreeks uit knop van het plasmamembraan 2.
Beide typen vesicles zijn omgeven door een lipide dubbellaag en bevatten nucleïnezuren, bijvoorbeeld DNA, mRNA of miRNA 3-5, en een overvloed aan eiwitten die ze kunnen overdragen aan aangrenzende cells. Terwijl in het algemeen de eiwitsamenstelling van de vesicles geeft de toestand van de cel van oorsprong, sommige eiwitten schijnen selectief gericht en verrijkt op EV 1. Een belangrijk onderzoek belang is om EV's van abnormale en zieke cellen te karakteriseren om specifieke EV handtekeningen die het gebruik van elektrische auto's als nieuwe biomarkers kunnen mogelijk te definiëren. Vooral bij kanker, waarbij vaak de tumor zelf niet gemakkelijk toegankelijk, kan vloeibare biopsieën gericht tumorspecifieke EV in bloed zodat controle van de behandeling of reacties te karakteriseren van de primaire tumor zonder dat invasieve procedures 6.
Inderdaad, EVS reeds met succes geïsoleerd uit verschillende lichaamsvloeistoffen zoals urine 7, CSF 8, moedermelk 9 of bloed 10. Verschillende studies die veranderingen in EV telt en samenstelling verschillende menselijke ziekten. Bijvoorbeeld bij sepsis patiënten het aantal pro-coagulant MVSaanzienlijk toegenomen in vergelijking met gezonde individuen 11. Ook bij patiënten met ernstige cerebrale malaria een toename van de totale MV in bloed kan worden waargenomen en tellingen van bloedplaatjes afgeleide MV correleren met coma diepte en trombocytopenie 12. Andere onderzoeken rapporteren verhoogde aantallen endotheel afgeleide blaasjes bij patiënten met systemische lupus erythematosus of hartfalen en bij de laatste, dit correleert met een hogere kans op cardiovasculaire aandoeningen 13,14.
Vooral bij kanker, EV's in het bloed worden momenteel besproken als nieuwe biomarkers met diagnostische en prognostische waarde. Niveaus van expressie MVs tumor-geassocieerde eiwitten zoals MUC1, EGFR of FAK lijkt te zijn verhoogd in het bloed van borstkankerpatiënten 15,16. Ook voor Exos recente studies hebben aangetoond dat bloed afgeleide Exos uitvoering tumorspecifieke antigenen zoals glypican-1 voor pancreaskanker en Del-1 voor borstkanker laten de vroege ziektebescherming met een hoge specificiteit en gevoeligheid 17,18. Bovendien kan serum afgeleide tumor Exos DNA dat kan worden gebruikt voor detectie van mutaties zoals KRAS en p53 die het gebruik ervan in therapie voorspelling 19 suggereert bevatten. Recente ontwikkelingen hebben aangetoond dat de analyse van Exos in het bloed van glioblastoma patiënten met behulp van een specifiek microfluïdische chip zorgt voor de opvolging van de therapie 20. Tezamen bieden deze bevindingen impliceren dat de analyse van de ziekte-specifieke subpopulaties van blaasjes geeft waardevolle informatie over de diagnose, prognose en therapeutische mogelijkheden en succes.
Echter, isolatie en analyse van Exos uit bloed is tijdrovend, vereist speciale laboratoriumapparatuur en dus nog niet geschikt voor routinematige klinische diagnostiek. Daarentegen kan MV sneller worden geïsoleerd en, vanwege hun grotere omvang, kan gemakkelijk worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie zonder te koppelen zij latex kralen als deze nodig zijn voor Exos 18, 21. Dus hier presenteren we een protocol dat kan worden gebruikt voor de isolatie van gestandaardiseerde MV's uit bloedmonsters en de daaropvolgende karakterisatie van MV subpopulaties met flowcytometrie. Dit protocol zal de verdere studie en diepgaande karakterisering van MV profielen in grote groepen patiënten, die met het oog op MV's voor de dagelijkse klinische diagnostiek gebruiken nodig zullen zijn toe te staan.
Recente studies EV in bloed aangetoond dat EV samenstelling en tellingen veranderen tijdens de oorzaak van verschillende ziekten. Daarom is de analyse en verdere karakterisatie van deze EV's van groot belang voor hun potentieel gebruik als ziekte biomarkers voor diagnose en prognose verder te beoordelen of de therapie te evalueren reacties. Het protocol hier geïntroduceerde maakt de isolatie van vesicles met een diameter tot 600 nm die geen celorganellen bevatten. Deze waarnemingen zijn in lijn met de huidige definitie van MV's en uitsluiting van de aanwezigheid van apoptotische lichamen 2. Met behulp van Western blotting, waren we aantonen dat de geïsoleerde MV's tonen een hoge expressie van tubuline, terwijl de tetraspanins CD9 en CD81 die vaak als Exo merkers werden slechts licht uitgedrukt. Dit bevestigt dat de MV's verschillen van Exos en past de recente grondige karakterisering en vergelijking van beide EV bevolkingsgroepen door proteomics 25.
content "> Tijdens verkrijging van bloedmonsters, is het essentieel om de tijd tussen venapunctie en plasma preparaat zo kort mogelijk teneinde MV straling beschermd blijven. Bovendien kan langdurige opslag van bloedmonsters leiden tot de activering van bloedcellen veroorzaken verhoogde MV vergieten en uiteindelijk apoptose die resulteert in het vrijkomen van apoptotische lichamen. Een andere belangrijke overweging voor MV isolatie om verontreiniging van MV preparaten voorkomen met plasmaproteïnen of kleiner Exos. Daarom is het essentieel om zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk na stoppen met draaien verwijderen MVS bij 14.000 x g. Aangezien de pellet normaal toegankelijk en stevig aan de wand van de buis, de bovenstaande vloeistof worden gemakkelijk verwijderd met een pipet tip. In tegenstelling tot Exos die de neiging hebben om aggregaten te vormen bij de bereiding van hoge snelheid ultracentrifugatie en zijn vaak moeilijk te mengen, doet dit probleem zich niet voor bij MV's.Onze studie toont aan dat het mogeble naar MV subpopulaties aanwezig in het bloed door middel van flowcytometrie karakteriseren. Hoewel de detectiegrens van de meeste stromingscytometers ongeveer 200-300 nm, werden MV reproduceerbaar gemeten donor en celkweek monsters met dezelfde parameters van de analyse en poorten die duidelijk stonden hun onderscheid met achtergrondsignalen. Het is belangrijk om te controleren voor de metingen die de PBS voor de analyses geen contaminerende deeltjes die een hoge achtergrond tijdens flowcytometrie (Figuur 3) kan veroorzaken. Hoewel sommige kleinere MV's niet kunnen worden meegenomen in een flow cytometrische benadering gedetecteerd we MV's van alle belangrijke bloedcelpopulaties (bijvoorbeeld bloedplaatjes, rode bloedcellen, leukocyten, endotheelcellen). In onze analyses gebruikten we standaard merkers voor de verschillende bloedcellen die eerder zijn gevonden MV's 26-29. Opgemerkt wordt dat, om een optimaal resultaat te verkrijgen door middel van flowcytometrie, tHij hoeveelheid en concentratie van antilichaampjes worden getitreerd op MV monster expressie het antigeen van belang. Indien specifieke MV subpopulaties in het bloed moeten worden geïdentificeerd met een hogere specificiteit, is het mogelijk om dubbele kleuring uit te voeren tegen twee verschillende antigenen aanwezig zijn op de respectievelijke MV's en alleen rekening houden met alle dubbele positieve MV's voor de daaropvolgende analyses 23. Momenteel zijn er pogingen om een standaard reeks MV subpopulaties in bloed van gezonde individuen 23,30 definiëren. Deze studies hebben al aangetoond dat bloedplaatjes afkomstige MV's vormen de grootste bevolking van MV's in het bloed, die in overeenstemming met onze observaties.
Een voordeel van stromingscytometrie MV monsters kenmerkend is dat deze methode is wel bekend voor diagnostische doeleinden in de meeste klinische centra die de mogelijke toepassing van MV's als biomarkers bij dagelijkse klinische diagnostiek mogelijk maken. Eerdere studies op EV's in het bloed die meestal focused op kleinere Exos, beroepen op sorteerinstallatie procedures om selectief analyseren de gewenste Exo doelgroep 31,32 of vereisen een tijdrovende (2 dagen) isolatiewerkwijze met koppeling van Exos aan korrels vóór de analyse 18 Latex. Onze eigen ongepubliceerde waarnemingen suggereren dat de flowcytometrische analyse van de MV's uit volbloed voorbereidingen van de detectie van MV's zoals tumor afgeleide MV's zonder een dergelijke selectieprocessen zelfs mogelijk.
Bij elkaar genomen, het protocol hier gepresenteerde maakt de snelle isolatie van MV's uit perifere bloedmonsters met standaard lab-apparatuur en de daaropvolgende karakterisering met behulp van flowcytometrie en Western Blotting. Het hele proces kan worden uitgevoerd in ongeveer 2 uur die eventuele studies naar MV profielen in het bloed van patiënten die nodig zijn om het potentieel van MV de ziekte biomarkers beoordelen vergemakkelijkt.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).
butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5µl for staining |
CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5µl for staining |
CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8µg for staining |
CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1µg for staining |
CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56°C) |
filter 0.22µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5000 in 5%BSA in TBST |
ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 |