Establecimiento de células tetraploides proliferativa de fibroblastos humanos no transformadas
Özet
Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.
Abstract
Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.
Introduction
Polyploidy se ha observado no sólo en tejidos especializados de las especies de mamíferos, sino también en una variedad de condiciones patológicas, como el cáncer y las enfermedades degenerativas. Células poliploides (en su mayoría tetraploides) se observan a menudo en lesiones preneoplásicas de tejidos humanos, tales como esófago 1,2 o escamosas lesiones intraepiteliales de Barrett del cuello del útero 3,4, y se han considerado para ser la fuente de células aneuploides en los tejidos malignos 5 , 6. Aunque se sugiere que la conversión de tetraploide a las células aneuploides podría ser un evento crucial en las primeras etapas de la tumorigénesis, los mecanismos implicados en este proceso no se entienden completamente. Esto es en parte porque no hay un modelo in vitro ha estado disponible en las células humanas no transformadas pueden propagarse poliploides.
Algunos investigadores han inducido tetraploidia en las células epiteliales humanas no transformadas a través de la generación de células binucleadas por INHibiting citocinesis 7-9. En este método, sin embargo, las células diploides innecesarios deben ser eliminados por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 7,8 o de clonación por dilución limitante 9. Debido a que estos procedimientos son laboriosos y no es fácil de realizar, métodos más simples para establecer se desean células tetraploides no transformadas para la investigación en este campo.
En el presente informe, se describe un protocolo para establecer células tetraploides de proliferación de fibroblastos humanos normales o fibroblastos humanos telomerasa inmortalizado por procedimientos relativamente simples. Los procedimientos utilizan husillo demecolcina veneno (DC) para detener las células diploides en la mitosis, las células mitóticas y recogidos por sacudiéndose se trata adicionalmente con CC. células mitóticas diploides tratados con DC durante un tiempo prolongado se convierten en células G1 tetraploides, y estas células proliferan como células tetraploides después de la detención del crecimiento durante varios días siguientes a la retirada de drogas. Este protocolo proporcionaun método eficiente para la creación de un modelo útil para estudiar la relación entre la inestabilidad cromosómica y el potencial oncogénico de células humanas poliploides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un problema importante en la inducción de tetraploidía a partir de células diploides por agentes químicos, ya sea por los inhibidores de citocinesis o por inhibidores del huso, es que las células se vuelven a menudo una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides, y las células tetraploides deben separarse de las células diploides. Los métodos más comunes para el aislamiento de una población tetraploide libre de células diploides utilizan FACS o la clonación por dilución limitante. Sin embargo, estos pro…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.
Materials
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
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