Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour étudier l'importation de protéines dans les chloroplastes isolés sous contrainte. La méthode est simple et rapide, et peut être appliqué pour étudier les conséquences des différentes conditions de stress pour les protéines de chloroplaste importation, et les mécanismes de régulation correspondants.
Les chloroplastes sont des organites avec de nombreux rôles essentiels dans les plantes, qui comprennent non seulement la photosynthèse, mais de nombreuses autres fonctions métaboliques et de signalisation. En outre, les chloroplastes sont critiques pour les réponses des plantes à divers stress abiotiques, tels que la salinité et les contraintes osmotiques. Un chloroplaste peut contenir jusqu'à environ 3000 protéines différentes, dont certaines sont codées par son propre génome. Cependant, la majorité des protéines de chloroplaste sont codées dans le noyau et synthétisée dans le cytosol, et ces protéines doivent être importées dans le chloroplaste par translocons au niveau des membranes d'enveloppe de chloroplaste. Des études récentes ont montré que l'importation de protéines de chloroplaste peut être régulée activement par le stress. Pour étudier biochimiquement une telle réglementation de l'importation de protéines dans des conditions de stress, nous avons développé la méthode décrite ici comme une procédure simple et rapide qui peut facilement être réalisé dans tout laboratoire. Dans ce procédé, des plantes sont cultivées en condition normalens et ensuite exposés à des conditions de stress dans une culture liquide. Le matériel végétal est recueilli, et les chloroplastes sont ensuite libéré par homogénéisation. L'homogénat brut est séparé par centrifugation à gradient de densité, ce qui permet l'isolement des chloroplastes intacts. rendement chloroplaste est évaluée par comptage et intégrité chloroplaste est vérifiée sous un microscope. Pour les essais d'importation de protéines, les chloroplastes purifiés sont incubés avec 35 S radiomarqué dans les protéines précurseurs traduites in vitro, et des expériences de temps cours sont menées afin de permettre les comparaisons des taux d'importation entre les génotypes dans des conditions de stress. Nous présentons des données générées en utilisant cette méthode, qui montrent que le taux de l'importation de protéines dans les chloroplastes d'un mutant réglementaire est spécifiquement modifié dans des conditions de stress osmotique.
Les chloroplastes sont des organites très abondantes qui existent dans les tissus verts de plantes. Ils sont bien connus pour leur rôle essentiel dans la photosynthèse, un processus qui utilise l' énergie lumineuse pour convertir le dioxyde de carbone en sucre et donc soutenir presque toute la vie sur terre 1. En outre, des chloroplastes (et la famille plus large des organites appelés liés plastides) jouent d'autres rôles essentiels dans les plantes, y compris la biosynthèse des acides aminés, des lipides, des pigments et de la détection des signaux environnementaux tels que la gravité et le défi de l'agent pathogène. Photosynthèse génère des espèces réactives de l'oxygène (ROS) comme sous-produits, qui, dans certaines circonstances ont des rôles utiles, mais si surproduit peut entraîner des effets néfastes, voire mortelles. La surproduction de ROS est particulièrement favorisée par des conditions environnementales défavorables, et donc chloroplastes sont étroitement liées aux réponses aux stress abiotiques, tels que la salinité et le stress osmotique 2.
Chloroplasts ont une structure complexe. Chaque chloroplaste est entourée d'une couche externe à double membrane appelée l'enveloppe, qui se compose de membranes externes et internes. En interne, il y a un autre système de membrane appelée les thylakoïdes, où les réactions légères de la photosynthèse ont lieu. Entre les deux systèmes de membranes il y a un appel compartiment aqueux du stroma, qui est impliqué dans la fixation du carbone. Un chloroplaste peut contenir jusqu'à ~ 3000 protéines différentes, et la grande majorité de ces protéines sont synthétisées dans le cytosol sous forme de précurseur et doivent être importés dans l'organite par translocons protéiques dédiés dans les membranes de l' enveloppe 1. Fait intéressant, des travaux récents ont montré que la protéine de chloroplaste importation est réglementée activement, et est donc en mesure d'exercer un important niveau de contrôle sur le protéome chloroplaste. Par exemple, il a été signalé en 2015 que l'importation de protéines peut répondre au stress abiotique par la réglementation directe de l'abondance des ee translocation à la membrane des chloroplastes enveloppe extérieure (TOC) par le système ubiquitine-protéasome 3.
Purifiés en utilisant des chloroplastes et des protéines précurseurs synthétisés in vitro, l' importation de protéines peut être reconstitué in vitro 4,5. Ainsi, les méthodes in vitro peuvent être utilisés pour évaluer les taux d'importation dans les différentes plantes mutantes 6, qui a été une approche critique pour l'analyse des composants putatifs de la machine à l'importation de protéines et pour découvrir les mécanismes sous – jacents l' importation de protéines et de sa réglementation. En outre, des chloroplastes peuvent être traitées avec un fractionnement supplémentaire ou digestion par protease, après l' importation in vitro, ce qui peut faciliter les études sur la localisation sub-organites et la topologie des protéines de chloroplaste 7,8.
Pour étudier la régulation de l'importation de protéines par le stress, nous avons modifié notre méthode d'isolement de chloroplaste de routine que nous allons décrireici. Surtout, les chloroplastes ont été isolés à partir de plantes qui ont été cultivées sur un milieu de Murashige standard et Skoog (MS) gélosé pendant 8 jours puis transférés dans un milieu MS liquide supplémenté avec facteur de stress, fournissant un temps relativement court, le traitement du stress contrôlé. Le rendement et la capacité de chloroplastes isolés à partir de ces plantes au stress traitées sont compatibles avec l'aval dans l' importation de protéines in vitro dosage 3. En plus du protocole d'isolement chloroplaste, nous présentons notre méthode de routine pour in vitro l' importation de protéines, qui a prouvé être robuste et est largement utilisé 3,9-12.
Nous avons récemment montré que chloroplaste l' importation de protéines peut être régulée activement par le stress, ce qui est essentiel pour la fonction de chloroplaste et survie de la plante 3. Dans cette étude, de suivre une telle réglementation, nous avons modifié notre isolement chloroplaste et dans les procédures d'essai d'importation in vitro afin de permettre l' évaluation de la capacité d'importation de plantes cultivées dans des conditions de stress. Les résultats indiquent un rôle important dans la régulation SP1 chloroplaste protéines d'importation.
Tests in vitro d'importation classiques utilisent des plantes cultivées sur MS norme milieu de gélose 6,17,18. Dans le cas du mutant sp1 décrit ici, de tels dosages conventionnels n'a pas révélé de différences dans l' importation de protéines par rapport au WT 3. Cependant, le rôle du SP1 dans la régulation de l' importation de protéines est clairement révélée lorsque l' importation de protéines est évaluée dans des conditions de stress en utilisant les procédés décrits ici (figure 1). Tandis qu'il may pas possible de comparer directement les données d'importation à partir des conditions de stress test avec ceux obtenus à partir de tests classiques (comme les méthodes utilisent les plantes cultivées en culture liquide et sur milieu agar, respectivement), les comparaisons entre le stress et les non-stress conditions sont réalisables à condition que les plantes cultivées sont tous dans le même milieu de culture liquide, avec ou sans facteurs de stress.
En comparaison avec le traitement du stress sur un milieu gélose, la culture liquide est plus commode pour le traitement des grands nombres de plantes nécessaires pour des tests in vitro à l'importation. Par ailleurs, il facilite l'application uniforme du facteur de stress à toutes les plantes, ce qui est particulièrement important pour les traitements de stress à court terme. La méthode présentée ici a été appliqué pour étudier le stress osmotique en utilisant un traitement de mannitol, mais pourrait facilement être adapté à un large éventail d'autres contraintes; par exemple, le stress de sel à court terme et le stress oxydatif, pour lesquels les facteurs de stress correspondants pourraient be appliquée de façon similaire par l'intermédiaire de milieu MS liquide. Pour les autres types de contraintes, nous suggérons le degré de stress est d'abord optimisé; trop sévères traitements peuvent avoir des effets néfastes sur le rendement et / ou de la compétence d'importation des organites isolés.
Il y a plusieurs étapes importantes dans le protocole auquel il faut accorder une attention particulière, comme détaillé ci-dessous.
La concentration optimale pour l'agar-agar du milieu MS peut varier (,6 à 0,9% en poids / volume) selon le fabricant. Par conséquent, il est recommandé d'optimiser empiriquement la concentration de la gélose avant de commencer les expériences. Le milieu ne doit pas être si doux qu'il colle au tissu à l'étape de récolte (étape 1.9), il ne devrait pas être si difficile qu'il inhibe le développement des racines des plantes. La concentration en saccharose peut également être ajustée en fonction des plantes utilisées. Lorsque l'on travaille avec des mutants particulièrement malades, milieu MS additionné de 2 – 3% (p / v) de saccharose peut aider les plantes à croître mieux. Lorsque l'applicationcouché traitements de stress, il est bon de transférer très vieilles plantes au milieu liquide (par exemple,> de 14 jours). Ceci est parce que les racines les plus développées de plantes plus âgées sont plus facilement endommagés pendant le transbordement.
En ce qui concerne le système de transcription / traduction, il existe 2 systèmes majeurs: ceux qui sont basés sur le germe de blé, et celles à base de reticulocytes de lapin. Ces kits peuvent utiliser différents modèles, tels que les plasmides linéarisés, plasmides unlinearized, ou des produits de PCR. Les kits sont également spécifiques pour les promoteurs T3, T7 et SP6. A noter que le kit il est recommandé ici ne peut être utilisé avec des produits de PCR et le promoteur T7. Cependant, pour des raisons inconnues, certains préprotéines radiomarqués faites avec ce système pourrait ne pas fonctionner efficacement dans le dosage d'importation; Dans de tels cas, on peut envisager d'essayer un système d'extrait de germe de blé ou d'un système de lysat de reticulocytes destiné à des modèles de plasmides. On peut aussi améliorer le résultat de la transcription / traduction reune action en modifiant les conditions de réaction selon le manuel du fabricant.
Il est important de commencer l'isolement chloroplaste tôt le matin (ou au début du cycle de lumière de la chambre de croissance) afin d'éviter l'accumulation d'amidon dans les chloroplastes en raison de la photosynthèse, ce qui peut nuire à l'isolement des organites intacts. La procédure d'isolement de chloroplaste doit être fait rapidement et sans retards inutiles, et les chloroplastes isolés doit toujours être conservé au froid. Ceci est d'atténuer l'observation qui a isolé les chloroplastes va progressivement perdre leur viabilité, ce qui est pas bon. Si vous utilisez CIB nouvellement décongelés ou tampon HMS, assurez-vous de mélanger le tampon avant utilisation pour obtenir une solution homogène. Les conditions optimales pour l'homogénéisation du matériel végétal ont été établies de manière empirique et peuvent varier en cas d'un homogénéiseur tissulaire différent est utilisé.
Si les différents génotypes végétaux contiennent similales niveaux de chlorophylle r, la chlorophylle quantification peuvent être utilisés comme une alternative pour normaliser les échantillons avant d'effectuer les essais d'importation. Chlorophyllienne peut être déterminée par spectrophotométrie après extraction d'un échantillon des chloroplastes isolés dans 80% (v / v) d' acétone aqueuse à 19,20. Cependant, si les taux de plantes d'importation montrent des teneurs en chlorophylle (par exemple, des mutants avec des phénotypes chlorotiques) sont à comparer, utiliser le numéro chloroplaste comptant pour normaliser les échantillons de chloroplastes dans les essais d'importation. Il est particulièrement important pour remettre en suspension les chloroplastes soigneusement à l'étape 3.11. resuspension insuffisante peut laisser des agrégats de chloroplastes, ce qui rendra difficile de compter le nombre avec précision et donc va entraver le chargement correct dans les réactions d'importation. Si l' agrégation sévère est vu sous le microscope (par exemple, des agrégats avec> 10 chloroplaste réunis), continuer en secouant l'échantillon de chloroplaste sur la glace jusqu'à ce que le aggregates sont supprimés. Il est plus facile à remettre en suspension les chloroplastes dans un plus petit volume de tampon.
Il est important de savoir que les réactions des protéines d'importation (section 5) doivent être menées avec les précautions appropriées en raison de leur nature radioactive. Les précautions nécessaires comprennent: le port de gants jetables, des vêtements de laboratoire et des lunettes de sécurité, la surveillance et la décontamination de la surface de travail et de l'équipement, et l'élimination de tous les déchets radioactifs dans un conteneur à déchets approuvé. Aussi garder à l'esprit que la pression osmotique correcte est essentielle pour le maintien de l'intégrité des chloroplastes lors des réactions d'importation, ce qui est principalement maintenu par le tampon HMS. Parce que 10x HMS est visqueux, il doit d'abord être réchauffé à la température ambiante, puis soigneusement mélangé et appliqué à l'aide d'une pipette de coupe pour assurer la mesure des volumes précis. Dans la réaction d'importation, la methionine froide est ajoutée pour inhiber l'incorporation de methionine radiomarquée libre dans aucun rapport chloroplast protéines par translation organites au cours de l'étape d'incubation, tandis que la BSA est utilisé pour minimiser la protéolyse, en agissant comme un substrat pour les protéases.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une subvention à PJ de la biotechnologie et biologique Sciences Research Council (BBSRC; accorder ref BB / K018442 / 1.).
Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
phytoagar | Melford | P1003 | |
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
filter paper | Fisher | FB59023 | |
Percoll | Fisher | 10607095 | |
ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
MgATP | Sigma | A9187 | |
methionine | Sigma | M6039 | |
bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
SDS | Fisher | S/5200/53 | |
Tris Base | Melford | B2005 | |
dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |