We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.
Il saggio piattaforma di espressione genica permette robusta e altamente riproducibili quantificazione dell'espressione di fino a 800 trascritti (mRNA o miRNA) in una singola reazione. Il saggio miRNA conta trascrizioni per l'imaging diretto e contando digitalmente molecole miRNA che sono etichettati con i set di colorati fluorescenti codice a barre della sonda (una sonda giornalista e una sonda di cattura). I codici a barre sono ibridate direttamente a maturare miRNA che sono stati allungati legando un tag oligonucleotide unico (miRtag) alla fine del 3 '. trascrizione inversa e l'amplificazione delle trascrizioni non sono richiesti. sonde Reporter contengono una sequenza di sei posizioni a colori popolate utilizzando una combinazione di quattro colori fluorescenti. I quattro colori oltre sei posizioni sono utilizzati per costruire una sequenza di colori del codice a barre gene-specifica. l'elaborazione post-ibridazione è automatizzato su una stazione della preparazione robotica. Dopo l'ibridazione, le sonde in eccesso vengono spazzate via, e le strutture tripartite (Capture Proessere-miRNA-giornalista sonda) sono fissati ad una slitta streptavidina rivestite tramite la sonda di cattura marcato con biotina. Imaging e codice a barre il conteggio viene fatto utilizzando un analizzatore digitale. I miRNA con codici a barre immobilizzati vengono visualizzati e ripreso con un microscopio e fotocamera, e i codici a barre unici sono decodificati e contati. il controllo di qualità dei dati (QC), la normalizzazione, e l'analisi sono facilitate da un software di elaborazione e analisi dei dati custom-designed che accompagna il software di analisi. Il saggio dimostra elevata linearità su una vasta gamma di espressione, così come l'alta sensibilità. Campione e la preparazione del test non comporta reazioni enzimatiche, trascrizione inversa, o di amplificazione; ha pochi passi; ed è in gran parte automatizzato, riducendo gli effetti investigatore e conseguente elevata consistenza e riproducibilità tecnica. Qui, descriviamo l'applicazione di questa tecnologia per identificare circolanti perturbazioni miRNA nella sindrome dell'intestino irritabile.
Sindrome dell'intestino irritabile (IBS) è la diagnosi ambulatoriale più comune in Gastroenterologia, affligge 10 – 15% della popolazione generale e rappresenta un onere rilevante per i servizi sanitari. Biomarker diagnostici Attualmente, non esistono generalmente accettato per IBS (vale a dire, la diagnosi si basa sui sintomi clinici e di escludere altre patologie organiche, come GI tumori maligni, malattie infiammatorie intestinali, e gastrointestinale (GI) infezioni). Quando si studiano i profili di espressione genica in condizioni comuni con istopatologia subclinico, come IBS, alta sensibilità e precisione (riproducibilità) sono necessari, come perturbazioni in profili di espressione genica sono spesso sottili 1-3. miRNA sono stati identificati come obiettivi sia diagnostiche e funzionali in IBS 4,5, e siamo particolarmente interessati a valutare il loro uso come biomarcatori di IBS-associati perturbazioni biologiche 3,4,6,7 circolanti. L'utilizzo clinico di circulabiomarcatori Ting è di interesse attuale a causa della facilità e della natura minimamente invasiva della collezione della fonte di biomarcatori '(ad esempio, sangue periferico) da pazienti.
Gene test piattaforma di espressione, a causa della loro chimica unica e semplificata, il flusso di lavoro in gran parte automatizzato, forniscono una piattaforma microarray che fornisce ampia e personalizzabile di copertura (800 obiettivi in una singola reazione) del trascrittoma per la scoperta mirata. Essi producono anche di alta precisione e linearità su un ampio spettro di livelli di espressione nella quantificazione degli obiettivi di trascrittomica. Il test non richiede la trascrizione inversa di RNA, l'amplificazione del cDNA risultante, o altre reazioni enzimatiche. Pertanto, eventuali errori introdotti dai numeri cicli elevati di amplificazione da specie di RNA a bassa abbondanza o varianti di splicing rare sono ridotte dal processo di conteggio digitali. Ciò significa che una grande varietà di tipi di campioni, come totale purificatoRNA (cioè, mRNA + miRNA), RNA da (FFPE) campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina, nonché lisati di tessuto greggio e cellulari, può essere utilizzato con i saggi.
RNA di interesse vengono rilevati utilizzando una coppia di sonde (cattura e sonde giornalista), ciascuno contenente una specifica sequenza bersaglio che riconosce una regione corrispondente RNA bersaglio. Al fine di garantire il rilevamento di RNA corte (cioè, miRNA), la sequenza miRNA maturo è allungato da ricottura a tag oligonucleotide unico (miRtag) all'estremità 3 'della molecola. Un oligonucleotide ponte, che è gratuito per una parte sia del bersaglio maturo miRNA e miRNA specifico miRtag, viene utilizzato per garantire la sequenza specificità. Cattura e giornalista sonde legare al 3 'e 5' estremità del complesso maturo miRNA-miRtag, rispettivamente. Le sonde di cattura hanno un'etichetta biotina all'estremità 3 ', che consentono loro di attaccarsi alla superficie di un vetrino streptavidina rivestite, Fixing la cattura della sonda-miRNA-miRtag-giornalista complesso sonda alla diapositiva. Una corrente elettrica viene quindi utilizzato per orientare il complesso sulla superficie di scorrimento, consentendo barre fluorescenti effettuate dalla sonda reporter estremità 5 'per essere osservata con un microscopio e charge-coupled device fotocamera (CCD). I codici a barre sono contati e decodificati, ottenendo un conteggio degli specifici miRNA bersaglio. Il codice a barre fluorescenti consiste di sei posizioni che possono essere occupati da uno dei quattro colori fluorescenti, che possono essere usati per costruire oltre 4.000 combinazioni di colore-codici a barre, ciascuna codifica per un RNA specifico.
Preparazione del campione (cioè, purificazione dell'RNA o cellule / tessuti Preparazione lisato), così come l'ibridazione delle sonde di cattura e giornalista, vengono eseguite al banco. Dodici i campioni possono essere multiplex su una singola diapositiva. Dopo l'ibridazione overnight, ogni ulteriore preparazione del campione viene effettuata da una stazione di preparazione robotica. I vetrini caricati vengono poi trasferiti annuncioanalizzatore igital per l'imaging, il conteggio, la decodifica e l'elaborazione dei dati. I dati risultanti vengono importati al software di accompagnamento, in cui vengono successivamente trattati con un alto grado di controllo utente. La chimica unica, semplice preparazione, la natura automatizzata, semplice tipo di dati (conteggi), e flusso di lavoro complessivo del saggio facilitare ad alta precisione l'espressione genica quantificazione, che lo rende uno strumento utile per lo studio circolanti profili di espressione dei miRNA e firme in condizioni funzionali come IBS.
I passaggi critici all'interno del protocollo
Per il saggio miRNA in particolare, è fondamentale non usare lisati non purificati (questi possono essere utilizzati in mRNA e saggi proteici), come i reagenti non sono stati ottimizzati per l'uso con lisati e reazioni preparazione del campione sono suscettibili di essere inibita. Inoltre, i contaminanti riportati dal gradini lisi e RNA depurazione (per esempio, composti guanidinio, etanolo, e fenoli) possono inibire le reazioni legatura e purificazione del campione. RNA buona qualità è quindi fondamentale per la sensibilità e l'accuratezza del test miRNA.
Utilizzando un termociclatore con un coperchio riscaldato è fondamentale per garantire il controllo della temperatura adeguata per migliorare il rendimento di tutte le fasi di reazione. Durante il passaggio 3.5.1, è importante non rimuovere le strisce del termociclatore in modo da mantenere la temperatura durante l'aggiunta della ligasi. Rimuovere le strisce per aggiungere la ligasicomprometterà la reazione. Quando si esegue la procedura di ibridazione, è fondamentale per evitare di muovere vigorosa, pipettaggio, o sfogliando durante la miscelazione dei reagenti nei tubi, in quanto ciò potrebbe tosare le sonde Reporter. Per garantire prestazioni ottimali e consistenza, è importante per mescolare completamente i reagenti nei tubi delicatamente sfogliando. girare sempre verso il basso le reazioni dopo la miscelazione, e utilizzare una nuova pipetta punta ogni volta che un reagente viene erogata per garantire pipettaggio preciso e per evitare accidentali contaminazione incrociata.
Modifiche e risoluzione dei problemi
I set di codici possono essere personalizzati per includere solo gli obiettivi di interesse. In questo modo, i costi possono essere equilibrati per consentire la verifica di grandi insiemi di campioni quando ulteriori indagini o la convalida di un bio-firma. Sonde personalizzate possono essere progettati per geni o meno destinazioni disponibili dal menu a la carte. La sensibilità per gli obiettivi meno abbondanti o RNA a bassa concentrazione può esseremanipolato consentendo per un tempo più lungo di ibridazione e / o utilizzando conteggio digitale risoluzione superiore.
Nel nostro studio abbiamo usato il predefinito 800 bersaglio pannello di miRNA con RNA totale da sangue intero; tuttavia, i test possono essere personalizzati per includere un minor numero di miRNA, se è necessario un approccio più mirato. Un totale di 24 campioni può essere preparato in un solo giorno, sfalsati in due gruppi di 12, perché due cartucce possono comodamente essere passati attraverso l'elaborazione post-ibridazione sulla stazione della preparazione robotica e ripreso l'analizzatore digitale il giorno successivo. trasformazione sfalsato dei campioni in lotti di 12 è importante per standardizzare il tempo di ibridazione. Le cartucce che sono stati immaginati possono essere salvati e conservati a 4 ° C per essere di nuovo a scansione se le analisi di dati suggeriscono che una scansione a risoluzione più elevata può migliorare l'individuazione dei miRNA più rari. Il rilevamento di molecole più rari può anche essere migliorata ibridare i campioni più a lungo; tuttavia, l'ibridazione prolungato può Result in sovrasaturazione e può solo migliorare i risultati se le concentrazioni di partenza di RNA sono bassi (come nel extracellulare RNA vescicole-derivato). la sensibilità e la precisione della piattaforma permettono relativamente miRNA bassa abbondanza da contare in modo affidabile.
LIMITI DELLA TECNICA
La piattaforma di test di espressione genica descritto può ospitare solo fino a 800 bersagli per array. Non è quindi adatto per gli studi trascrittoma intero complesso miRNA-trascrittoma /. Solo noti, descritti, e gli obiettivi specifici possono essere rilevati utilizzando la piattaforma, quindi non è adatto per la scoperta di nuove specie molecolari. Altri metodi, come RNA-Seq o altri metodi tradizionali microarray, sono più adatti a tutto il trascrittoma studi esplorativi.
Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
IBS è caratterizzato da una combinazione di sintomi, prinpalmente tra cui dolori addominali; ipersensibilità viscerale; e cambiamenti nelle abitudini intestinali, come diarrea frequente, costipazione, o una combinazione di entrambi 9,10. Sintomi di IBS non hanno causa organica conosciuta, ed i pazienti non presentano con l'infiammazione clinicamente significativa, perturbazioni istopatologiche di tessuti gastrointestinali, o marcatori sistemici 9-12. La ricerca suggerisce che disregolazione biologica in IBS è sottile, subclinica, ed eterogeneo, con temi comuni emergenti di tutto l'infiammazione e immune funzione 10. Pertanto, abbiamo bisogno di controllare la variazione sperimentatore-introdotto e utilizzare una piattaforma che era in grado di rilevare in modo affidabile perturbazioni sottili di espressione genica. Le caratteristiche uniche del saggio e del sistema standardizzare campione di trasformazione e di ridurre sperimentatore gestione attraverso l'automazione, la riduzione della varianza tecnica di produrre dati altamente riproducibili. Queste caratteristiche consentono di indagini mirate e producono molto preciso e rdati eplicable. Questo permette la rilevazione di perturbazioni sottili e perturbazioni tra obiettivi bassa espressione che può essere trascurato o sommersi dai segnali di bersagli più abbondanti utilizzando intensity- o amplificazione basati i metodi. microarrays basati sulla PCR e metodi di RNA-Seq sono valide alternative per l'utilizzo della piattaforma descritto e possono essere attraente come alternativa quando throughput più elevati sono necessari o quando l'obiettivo è quello di caratterizzare l'intero trascrittoma o per cercare nuove molecole. Tuttavia, alternative non possono eseguire così in modo accurato e sensibile il rilevamento e la quantificazione degli obiettivi rare e perturbazioni sottili.
Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Di circolazione miRNA nei partecipanti IBS ha mostrato una serie di perturbazioni che sono stati trovati ad essere sia significativo e coerente all'interno delle categorie. I miRNA identificati sono stati associati con pathwa rilevantiys e condizioni patologiche, tra cui una condizione funzionale del dolore (miR-342-3p: dolore vescicale cronica) 8 e l'infiammazione (miR-150) 13. Lo studio esempio è stato basato su una coorte esplorativo utilizzato per definire obiettivi e sistemi di interesse. Una più mirato, più piccola serie miRNA è stata poi costruita, abbassando il costo per ogni campione e consentendo coorti molto più grandi da analizzare in un modo economicamente efficace, al fine di convalidare e perfezionare le firme e biomarcatori. Il sistema di analisi piattaforma di espressione genica rappresenta un equilibrio tra la natura esplorativa tradizionale del microarray e più mirato, la raccolta dei dati ipotesi-driven per affinare e testare le firme molecolari e biomarcatori 14-16. Il metodo viene usato per esaminare perturbazioni molecolari e proteine in vivo e in vitro dove i miRNA bersaglio descritti sono sperimentalmente over-espressa o inibita. Nuovi saggi consentono la quantificazione simultanea di mRNA e proteins direttamente da lisati di cellule e tessuti. Inoltre, ottimizzando la purificazione di frazioni specifiche di sangue periferico e escrementi (ad esempio, l'urina) e di ottimizzare e migliorare alcuni parametri del test, i profili molecolari e firme di frazioni concentrazione molecolare basso (ad esempio, frazioni exosomal) saranno esaminati.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.
nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Pipettes (1000, 100, 20, 10ul) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
nSolver | Nanostring | N/A | Essential |