Visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos

1. Preparar la biblioteca de scFv como una fusión con la secuencia señal ssTorA Obtener una biblioteca de ácido desoxirribonucleico (ADN) que contiene variantes de un gen de scFv. NOTA: La biblioteca también puede construirse usando cualquier modo apropiado para generar diversidad en todo el gen scFv o dominios específicos 22 (por ejemplo, la tercera regiones determinantes de complementariedad, CDR3.). Insertar la biblioteca de ADN en el plásmido PIMD (Figura 2), utilizando métodos de clonación molecular estándar 23. NOTA: Este plásmido expresa scFv como una fusión genética de la secuencia de señal ssTorA (N-terminal de scFv) y la etiqueta de epítopo FLAG (C-terminal a la scFv). El diseño del plásmido para la visualización de la membrana interna se ha descrito previamente 19. El plásmido PIMD está disponible de los autores. <br/> Figura 2. Pantalla plásmido-membrana interna (PIMD) mapa (pasos 1.2 a 1.3). Este plásmido contiene un promotor lac, el origen ColE1 de replicación, y un gen de resistencia a cloranfenicol. El gen scFv insertado se fusiona con la secuencia señal ssTorA para apuntar el scFv a la vía de Tat y a una etiqueta de epítopo FLAG, con los tres en el mismo marco de lectura. sitios de enzimas de restricción se indican. Para una biblioteca insertado entre los sitios de enzimas de restricción XbaI y NotI, el tamaño del plásmido es 2219 pb más el tamaño del scFv. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Transformar el ADN plásmido que contiene la biblioteca en MC4100 de E. 23 células de E. coli. Recuperarse y crecer esta forma bacteriana de la biblioteca. Centrifugar a 4000 xg durante 15 min a TA para recoger las células. Eliminar el sobrenadante, y resuspender las células recogidasen 25% de glicerol en Luria-Bertani medios (LB). alícuotas almacenar a -80 ° C hasta que se necesite, o continúe con el paso 2. NOTA: El protocolo ha sido verificado con células MC4100, aunque otras E. También se espera que las cepas de E. coli para ser compatible con el protocolo. La electroporación es el método preferido para la transformación, debido a su alta eficiencia de transformación. La biblioteca típicamente debe consistir en al menos 10 9 scFv variantes en esta etapa, y cada alícuota debe contener suficientes células de manera que la biblioteca está cubierta 100 veces. 2. Expresar la Biblioteca y Preparar esferoplastos Descongelar una alícuota de la biblioteca bacteriana (del Paso 1.3) a temperatura ambiente, y añadir la alícuota a un matraz que contenía 100 ml de medio LB con 20 mg / ml de cloranfenicol (Cm). Crecer durante 3 horas a 37 ° C y 225 rpm en un agitador se incubaron. Después de 3 horas, retirar el matraz del agitador se incubaron 37 ° C. Permitir la expresión de la biblioteca de scFv aproceder O / N para 15 a 22 horas a 20 ° C y 225 rpm en un agitador se incubaron. NOTA: No se necesita inductor cuando se utiliza el plásmido PIMD, como el promotor tiene fugas. Tenga en cuenta que las células MC4100 no sobreexpresan el represor Lac (y LacI no se encuentra en el plásmido). Figura 3. células de E. coli y esferoplastos. (A) E. coli células son de forma cilíndrica. (B) Después de formación de esferoplastos usando EDTA y lisozima, la membrana exterior de la E. coli células se rompen, y los esferoplastos resultantes son de forma esférica. De contraste de interferencia diferencial (DIC) Imágenes de microscopía se obtuvieron utilizando un objetivo de 100X en un microscopio invertido. Por favor, clamer aquí para ver una versión más grande de esta figura. Preparar los esferoplastos biblioteca. NOTA: Los esferoplastos se forman por la ruptura de la membrana externa de E. coli y son de forma esférica (figura 3). Preparar los tampones necesarios. NOTA: Todos los tampones deben ser estériles. Preparar 1 × solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4) disolviendo 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4, y 0,24 g KH 2 PO 4 en H 2 O destilada a un volumen final de 1.000 ml. Mantener en hielo. Preparar PBS con 0,1% (w / v) de suero de albúmina bovina (BSA) por disolución de 0,2 g de BSA en 200 ml de 1 x PBS. Mantener en hielo. Preparar el tampón de fraccionamiento (FB) mezclando 7,5 ml de H 1 M de sacarosa, 1 ml de tampón de Tris 1 M (pH 8,0), y 1,5 ml filtrada estéril destilada 2 O. Mantener en hielo. Preparar 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) mediante la adición de 30 l of EDTA 0,5 M a 14.97 ml H2O destilada Preparar 0,5 M MgCl2 disolviendo 4,76 g de MgCl 2 en 100 ml de H2O destilada Mantener en hielo. Retirar el matraz del agitador, y medir la densidad óptica (DO) a 600 nm utilizando un espectrofotómetro para determinar la densidad celular. Calcular el volumen de cultivo inducido sea necesario de manera que cada muestra para formación de esferoplastos tiene 1 × 10 10 células. NOTA: La aproximación de una DO 600 de 1 que indica una concentración de 10 9 células / ml para E. coli se puede utilizar 24. Centrifugar el volumen calculado de cultivo inducido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 12.000 × g a TA durante 5 min. Preparar al menos dos muestras en el caso de que se plantee una cuestión de preparación de la muestra. Eliminar el sobrenadante de los cultivos se centrifugaron y resuspender cada sedimento celular en 100 l de FB enfriado con hielo. Centrifugar a 12.000 ×g a TA durante 1 min, y luego eliminar el sobrenadante mediante pipeteo. Resuspender cada sedimento en 350 l de FB enfriado en hielo suplementado con 3,5 l de 10 mg / ml de lisozima. vórtice lentamente cada tubo mientras se añade, gota a gota, a 700 l de EDTA 1 mM, y luego se incuban los tubos a TA durante 20 min mientras que gira lentamente en un mezclador de tubo para mezclar las muestras. Retire los tubos del agitador, se añaden 50 l de helado 0,5 M MgCl 2 a cada tubo, y se incuba en hielo durante 10 min. Centrifugar los tubos a 11.000 × g a 4 ° C durante 10 min. Aislar el pellet de esferoplastos. Utilice una micropipeta con una punta de 1 ml para extraer lentamente hasta parte de pellets. Mientras sostiene el tubo en un ángulo con la abertura directamente encima de un nuevo tubo de 1,5 ml, levante lentamente la punta de pipeta fuera del sobrenadante y deslice el pellet en el nuevo tubo. Si un volumen significativo de sobrenadante se transfiere al nuevo tubo, y eliminar con la pipeta. Si la pastilla no es firme enouf para transferir, re-centrifugar a 11.000 xg durante 2 min y el aislamiento pellet intento de nuevo. Resuspender el pellet de esferoplastos en cada tubo en 1 ml de helado 1 × PBS. Alternan entre la pipeta y el vórtex lentamente en un gancho o agitar hasta que el sedimento se volvió a suspender totalmente. No mantener las muestras fuera del hielo durante más de 2 min a la vez, y volver a la hielo durante al menos 5 min antes de sacarlo del hielo de nuevo. Mantenga los esferoplastos a 4 ° C (para un máximo de 2 días) hasta que se usaron para la expansión en el paso 4. 3. Se debe inmovilizar el antígeno diana en perlas magnéticas Biotinilar el antígeno diana in vivo durante la producción recombinante en E. células de E. coli. Como alternativa, utilice la conjugación química 25 o antígeno objetivo de compra que ya ha sido biotinilado, y vaya al paso 3.2. Añadir 816 g bicina a 50 ml de agua para hacer 10 × tampón bicina. Se diluye la buffer a 1 × en H2O destilada y se calienta a 50 ° C. Añadir 14,7 mg de biotina a 12 ml de la climatizada tampón 1 × bicina para hacer una solución de biotina que es biotina 5 mM en 10 mM de tampón bicina. Almacenar a -20 ° C hasta que se necesite. Expresar y biotinilar la proteína diana utilizando el plásmido pAK400cb-BCCP 26, que permite la producción del antígeno diana como una fusión con la proteína portadora de carboxilo biotina (BCCP). NOTA: E. células de E. coli nativa biotinilar BCCP, eliminando la necesidad de purificar y químicamente biotinilar la proteína diana antes de la inmovilización sobre perlas recubiertas con estreptavidina. El E. nativo coli biotina ligasa BirA es suficiente para biotinilar la proteína de fusión. Crecer E. coli que contiene el plásmido de biotinilación (con el antígeno diana insertado como una fusión a la N-terminal de BCCP) O / N durante 15 a 18 horas en 5 ml de medio LB suplementado con 20 g / ml Cm a 37 ° C con agitación a 225 rpm. Medir la DO a 600 nm usando un espectrofotómetro y se calcula el volumen de cultivo necesario (V ADD) a subcultivo en un OD a partir de 0.05 en 25 ml de medio LB fresco con 20 mg / ml Cm usando la ecuación: V añadir = (0,05 × 25 ml) / (OD 600 a 0,05), donde OD 600 es la densidad óptica de la cultura O / N y V añadir es el volumen del cultivo O / N para añadir a la LB. fresco Subcultivo y crecer hasta una DO de 0,5 a 0,8 en un agitador se incubaron a 37 ° C y 225 rpm. Añadir isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido a una concentración final de 100 mM y biotina a una concentración final de 5 mM. Inducir la expresión en un agitador se incubaron durante 15-22 horas a 20 ° C y 225 rpm. bacterias de la cosecha por centrifugación a 4000 × g a 4 ° C durante 10 min. Eliminar el sobrenadante. Almacenar el sedimento a -20 ° C hasta que esté listo para su uso. Añadir1 ml de un detergente de lisis de células por 0,2 g de sedimento celular. Resuspender mediante pipeteo y rotar suavemente durante 20 min para lisar las células. Después de la lisis, se centrifuga a 16.000 x g y 4 ° C durante 20 min. Pipetear el lisado soluble (sobrenadante) en un nuevo tubo de 1,5 ml. Utilice una columna peso molecular de corte de 3 kDa para eliminar la biotina no unido. Pipetear el lisado en la columna, y se centrifuga a 20 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Lavar con 1 x PBS hasta que la biotina en el lisado se ha diluido 100 veces y el volumen del lisado de lavado es igual al volumen original del lisado. Transferir el lisado a un tubo nuevo. Inmovilizar el antígeno diana biotinilado sobre perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Preparar 1 × PBS y 1 × PBS con 0,1% de BSA (v / w) como se describe en el paso 2.3.1. Preparar las perlas magnéticas. NOTA: Esto requiere el uso de una rejilla de separación magnética. streptav ResuspenderIdin-perlas magnéticas recubiertas en su envase original. Cualquiera de vórtice durante al menos 30 seg o girar durante 5 min. Transferencia 7-10 × 10 9 perlas a un tubo de 1,5 ml. NOTA: El volumen requerido dependerá de la concentración de talón suministrado por el fabricante. Se coloca el tubo que contiene las perlas en el estante imán para 2 min para recoger las perlas en el lado del tubo. Con el tubo todavía en el imán, retirar con cuidado el sobrenadante con la pipeta sin interrumpir las perlas. Para lavar, quitar el tubo del imán, y volver a suspender las perlas en 1 ml de PBS 1X con la pipeta sin generar burbujas. Vuelva a colocar el tubo al imán durante 2 minutos para recoger las perlas, y retirar con cuidado el sobrenadante con la pipeta. Repetir el proceso dos veces más para un total de tres lavados. Asegúrese de que el líquido no se deja en el tubo después del lavado final. Añadir el lisado que contiene el antígeno biotinilado a la bea magnéticads. Retire el tubo del imán y resuspender las perlas en 1 ml de lisado (de la etapa 3.1.5). Incubar a RT durante 30 min mientras se gira suavemente. Se coloca el tubo en el imán durante 3 min para recoger las perlas recubiertas de antígeno. Lavar las perlas recubiertas cinco veces con 1 x PBS con 0,1% de BSA en la misma manera como se describe en los pasos 3.2.2.3 a 3.2.2.4. Después del lavado final, resuspender las perlas en 1 × PBS con 0,1% de BSA hasta el mismo volumen utilizado en el paso 3.2.2.2. Si el antígeno diana inmovilizada es estable a 4 ° C, almacenar las perlas recubiertas a 4 ° C hasta que sea necesario para la expansión. De lo contrario, continúe con el paso 4. 4. Pantalla de la biblioteca de scFv mediante los movimientos horizontales contra el antígeno diana (Figura 4) Figura 4. Toma panorámica (Paso 4). Recubiertas de antígeno perlas magnéticas are incubó con esferoplastos que expresan variantes de la biblioteca de anticuerpos. El plásmido ADN de esferoplastos de talón unido se recupera y se utiliza para generar una sub-biblioteca, que se analiza usando la pantalla secundaria basado en ELISA. Correspondientes pasos del protocolo se indique lo contrario. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Se incuban las perlas recubiertas con esferoplastos. Utilice una de esferoplastos a talón relación de aproximadamente 5: 1. Añadir 4 × 10 9 esferoplastos y 8 × 10 8 perlas a un tubo estéril de 15 ml. NOTA: Se supone que no hay células se perdieron durante el proceso de formación de esferoplastos, por lo que la concentración es todavía 1 × 10 10 esferoplastos / ml. Añadir 1 × PBS con 0,1% de BSA para llevar el volumen total a 4 ml. Alícuota en cuatro tubos de 1,5 ml con 1 ml cada uno. Se incuban las reacciones a 4 ° C durante 5 horas mientras se gira suavemente. Prepare los esferoplastos talón determinada para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Colocar los tubos de reacción paneo en el imán durante 3 min. Eliminar el sobrenadante por pipeteo, y lavar los esferoplastos de talón unido a cuatro veces con hielo frío 1 × PBS con 0,1% de BSA en la misma manera como se describe en los pasos 3.2.2.3 a 3.2.2.4. Volver a suspender los esferoplastos talón de ruedas en cada tubo en 25 l de H2O destilada Almacenar los granos a -20 ° C o continúe en el paso 4.3. Realizar todo el plásmido PCR en esferoplastos talón de ruedas para amplificar los plásmidos que contienen los genes de scFv talón de ruedas. Obtener cebadores con las siguientes secuencias: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 '(cebador directo) y 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3' (cebador inverso). NOTA: Estos se unirá de extremo a extremo de las cadenas opuestas del plásmido PIMD (Figura 2) y están diseñados para hibridar con una característica común de PIMD, por lo que la amplificación se producirá con independencia de lasecuencia variante scFv. Fosforilar los cebadores. Nota: Sin fosforilación, no se producirá re-ligación. Los cebadores también pueden pedirse con 5'-fosforilación, en lugar de utilizar este método fosforilación en este protocolo. En un tubo de 0,5 ml, configure una reacción de fosforilación para el cebador de PCR directo como se describe en la Tabla 1. Repita este proceso para el cebador inverso. Se incuban las reacciones a 37 ° C durante 1 hora. Entonces incubarlos a 65 ° C durante 20 minutos para desactivar el polinucleótido quinasa de T4 (PNK). Almacenar los cebadores fosforilados a -20 ° C. Realizar la PCR. En un tubo de PCR, preparar la reacción de PCR como se describe en la Tabla 2. NOTA: reacciones múltiples pueden ser preparados para un mayor rendimiento. Los esferoplastos de talón de ruedas no utilizados se pueden almacenar a -20 ° C. Calentar las reacciones de PCR a 98 ° C durante 15 min en un ciclador térmico para asegurar la lisis completa de los esferoplastos. Retire los tubos del termociclador, y añadir 0,5 l de una polimerasa de alta fidelidad de cada uno. Volver tubos para el termociclador y ejecute utilizando el programa detallado en la Tabla 3. Agrupar los productos de la PCR, según proceda. Almacenar a -20 ° C o continúe en el paso 4.4. Tabla 1. reacción de fosforilación PNK (Paso 4.3.2.1). Reactivo Volumen (l) H2O destilada 15 tampón de reacción de ligasa de ADN T4 10x 2 imprimación 100 M 2 T4 polinucleótido quinasa (PNK) 1 ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-con-next.within-page =" always "> Tabla 2. Toda la reacción de PCR-plásmido (Paso 4.3.3.1). Reactivo Volumen (l) H2O destilada 28.5 5x tampón de alta fidelidad de la polimerasa 10 cebador directo 10 M fosforilada 2.5 cebador inverso 10 M fosforilada 2.5 40 mM dNTP mix (10 mM de cada dNTP) 1 esferoplastos talón de ruedas 5 Tabla 3. programa de PCR (Paso 4.3.3.2). <tbody> Paso Temperatura (° C) Tiempo (min: seg) Número de ciclos desnaturalización inicial 98 doce y media 1 Desnaturalizar 98 doce y diez 35 Recocido 69 doce y media Extensión 72 Doce y treinta por kb La extensión final 72 06:00 1 Sostener 12 Infinito 1 Re-distribuir circulares enteros plásmido los productos de PCR, y utilizar el producto ligado para transformar E. MC4100 células de E. coli. Se purifica el producto de PCR mediante la ejecución de la reacción de PCR en un gel de agarosa al 23, manchando el ADN en el gel 23, y usando unakit de limpieza en gel para purificar el plásmido linealizado siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Medir la concentración usando un espectrofotómetro a 260 nm. Almacenar el fragmento purificado a -20 ° C hasta que sea necesario, o continuar con el paso 4.4.2. Re-circularizar plásmido a partir del producto PCR. Para evitar la ligación intermolecular del producto de PCR, llevar a cabo la reacción de ligación con una baja concentración de 27 1 ng / l de producto de PCR. Calcular el volumen necesario para la preparación de una reacción de ligación 800 l a esta concentración. Preparar la reacción de ligación en hielo. En un tubo, añadir el volumen calculado en el paso 4.4.2.1 del producto de PCR, 80 l de tampón ligasa 10 × ADN, y H 2 O destilada hasta 800 l. Añadir 4 l de ADN ligasa de T4, e inmediatamente colocar los tubos a 16 ° C en un baño de agua o el termociclador. Se incuba a 16 ° CO / N de 14 a 18 h. Almacenar las reacciones de ligación completados a -20 ° Chasta que sea necesario, o continúe en el paso 4.4.3. Coloque la reacción de ligación en un bloque de calor a 65 ° C durante 15 min para calentar-inactivar la ADN ligasa. A continuación, utilice un kit de limpieza de membrana de microdiálisis o ADN de de-sal del ADN ligado. Almacenar a 20 ° C o continúe en el paso 4.4.4. Utilizar todo el, producto de ligación de-salada inactivado por calor para transformar MC4100 de E. 23 células de E. coli. Preparar las existencias de glicerol, como se describe en el paso 1.3, de las células que contienen el sub-biblioteca criticada resultante, y alícuotas almacenar a -80 ° C. Repita el paso 4 en su totalidad utilizando una parte alícuota de la Etapa 4.4.4 hacer una segunda toma panorámica en la sub-biblioteca. NOTA: Una segunda paneo ayuda a enriquecer la biblioteca de componentes que se unen así al antígeno diana 19. 5. Realizar una pantalla secundaria utilizando un método de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas para identificar clones prometedores para una caracterización adicional (Figura 5) </P> Cribado basado en ELISA Figura 5. secundaria (Paso 5). Variantes (A) Biblioteca de la sub-biblioteca enriquecida durante panning se inoculan en pocillos individuales de una placa de cultivo para el crecimiento y expresión. (B) Un plato de ELISA se recubre con antígeno diana. (C) Las variantes de la biblioteca se seleccionan utilizando la pantalla secundaria basado en ELISA descrito en el protocolo. Tras el análisis de los datos obtenidos a partir de la pantalla secundaria, las variantes de interés se seleccionan y se caracterizan además. Correspondientes pasos del protocolo se indique lo contrario. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Descongelar un tubo de la sub-biblioteca criticada (de la etapa 4.4.4) y la placa en placas de agar LB. Placa varias dilucionesen concentraciones lo suficientemente bajas como para asegurar colonias individuales (por ejemplo, 10 2 – 10 6 diluciones -fold). Las placas se incuban durante 15 a 18 horas a 37 ° C. Almacenar las placas a 4 ° C o continúe en el paso 5.2. Cultura e inducir colonias de la sub-biblioteca criticada. Realizar todas las etapas en condiciones estériles. Utilice una pipeta multicanal para los pasos que implican placas de 96 pocillos. Añadir 200 l de LB con 20 mg / ml Cm en cada pocillo de una placa de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos. Escoja una colonia individual de la placa de agar con una punta de pipeta, coloque la punta en el primer pocillo de la placa de 96 pocillos y agitar suavemente para inocular. Utilizar una punta para cada pozo. Inocular una colonia en cada pocillo. Como control, incluir al menos un control de esterilidad bien con ninguna colonia inoculado. Repita los pasos 5.2.1 y 5.2.2 para inocular varias placas de 96 pocillos. Colocar las placas de 96 pocillos en un agitador de microplacas a 310 rpm. Incubar a 376; C durante 20 a 24 horas para expresar los scFv. Para cada placa de cultivo preparado en el Paso 5.2, capa uno de 96 pocillos de placas de ELISA con el antígeno diana. Diluir el antígeno diana purificada hasta una concentración apropiada (por ejemplo, 1 mg / ml a 4 mg / ml) en 1 x PBS para hacer la solución de revestimiento. Hacer 5 ml de solución de recubrimiento para cada placa de 96 pocillos. NOTA: La concentración apropiada depende del antígeno específico que se utiliza y puede ser necesario ajustar. Añadir 50 l de la solución de revestimiento a cada pocillo de una placa de poliestireno ELISA claro de 96 pocillos de alta unión. Golpear suavemente la placa sobre la superficie de mesa para asegurarse de que toda la superficie de cada pocillo se recubre. Repita este procedimiento para cada placa. Se incuban las placas a 4 ° CO / N. Replicar las colonias de las placas de cultivo de 96 pocillos en placas de agar. Coloque un replicador de poliestireno estéril en los pocillos de una placa de cultivo para recoger una pequeña cantidad de jabón lcarné de identidad. Levante con cuidado el replicador y transfieren a una placa de agar LB 15 cm de tal manera que todas las puntas estén en contacto con la placa. Una vez que el líquido se haya transferido, levante el replicador hacia arriba. Repita este procedimiento para cada placa de cultivo. Etiqueta de la placa de agar con la orientación correcta de manera que los resultados de la pantalla secundaria en la placa de 96 pocillos se pueden combinar con la colonia replicado correcta en la placa, si se desea una caracterización adicional. Crecer a 37 ° C durante 15 a 18 horas, y luego se almacena a 4 ° C hasta que se necesite. Realizar la pantalla secundaria ELISA. Preparar la solución de bloqueo al hacer 2% (w / v) de leche en polvo en 1 × PBS. Vaciar la solución de recubrimiento de las placas de ELISA. Añadir 100 l de la solución de bloqueo a cada pocillo. Se incuba a temperatura ambiente durante al menos 2 horas, o bloque de O / N a 4 ° C. Preparar el tampón de lavado mediante la adición de polisorbato 20 a una concentración final de 0,05% en 1 x PBS. Hacer 250 ml por placa de ELISA. Añadir 20 l de unaconcentrada lisis celular detergente a cada pocillo de la placa de cultivo de fondo redondo, y se incuba la placa de cultivo en un agitador de microplacas a temperatura ambiente durante 15-20 min. Comience la lisis al mismo tiempo que el bloqueo de las placas de ELISA se completa de manera que la lisis y el lavado Paso 5.5.4 se pueden realizar simultáneamente. Vaciar la solución de bloqueo de las placas de ELISA. Se lavan las placas de ELISA bloqueados cuatro veces con 200 l de tampón de lavado por pocillo por lavado. Vaciar el buffer de lavado de los pocillos. Transferencia de 50 l de cada pocillo de la placa de lisis celular al pocillo correspondiente de la placa de ELISA, utilizando una punta nueva para cada pocillo. Se incuba la placa ELISA a temperatura ambiente durante 1-2 h. Preparar la solución de anticuerpos para detectar scFv unidos. Utilice una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo primario que se une al epítopo etiqueta FLAG fusionada a los scFv de la biblioteca. Diluir el anticuerpo a la dilución apropiada para usar en un ELISA (véase el proveedor & #39; s recomendaciones) en 2% (w / v) de leche en polvo en el 0,05% de polisorbato 20 en 1 × PBS. Preparar 5 ml de cada plato. Lavar las placas ELISA cuatro veces con tampón de lavado como se describe en el paso 5.5.4. Añadir 50 l de la solución de anticuerpo a cada pocillo de la placa de ELISA. Incubar durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. Preparar el sustrato de HRP disolviendo o-fenilendiamina diclorhidrato de tabletas (OPD) en H 2 O destilada por el protocolo del fabricante, evitando la luz. Preparar 20 ml por placa de ELISA. Preparar 3 MH 2 SO 4 diluyendo H 2 SO 4 concentrado con H 2 O destilada si es necesario. Preparar 5 ml por placa de ELISA. Precaución: H 2 SO 4 es un ácido fuerte. Asegúrese de usar el equipo de protección personal adecuado. Lavar las placas ELISA cuatro veces con tampón de lavado, como se describe en el paso 5.5.4. Incubar las placas de ELISA con el Substra HRPte. Añadir 200 l de sustrato HRP a cada pocillo. Para minimizar la exposición a la luz, añadir el sustrato para una placa de ELISA en un momento, y se envuelve con papel de aluminio antes de proceder a la siguiente placa. Incubar las placas durante 30 a 60 min a TA en la oscuridad. Después de la primera 30 min, comprobar las placas para el oscurecimiento del sustrato, y se incuba durante más tiempo si es necesario para visualizar el desarrollo de color. Añadir 50 l de 3 MH 2 SO 4 a cada pocillo para detener la reacción. Utilizando una punta diferente para cada pocillo, se mezcla la solución en los pocillos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo sin formación de espuma. Por razones de coherencia y para evitar la saturación, añadir el H 2 SO 4 rápidamente y con cuidado para todas las placas de ELISA antes de la mezcla la solución para cada placa. Medir la absorbancia de la solución en los pocillos de cada placa a 492 nm usando un lector de placas. Analizar los datos de absorbancia para identificar variantes de scFv que exhibprometiendo que las señales de unión y caracterizar estos scFv prometedores. Seleccionar los scFv que exhiben señales de absorbancia superior a la señal de fondo y superior a la media de la señal en cada plato. NOTA: El nivel de absorbancia dependerá de las propiedades del antígeno y el anticuerpo anti-FLAG utilizadas, junto con la fuerza de las variantes scFv que fueron aislados en el cribado.