Bakterielle Inner-Membran-Display für das Screening einer Bibliothek von Antikörperfragmenten

1. Bereiten Sie die scFv Bibliothek als Fusion mit dem ssTorA Signalsequenz Besorgen Sie sich eine Desoxyribonukleinsäure (DNA) Bibliothek Varianten eines scFv-Gen enthält. HINWEIS: Die Bibliothek auch konstruiert werden , kann jede geeignete Modus Diversität über die gesamte scFv – Gen oder gezielte Domänen zu erzeugen , 22 (beispielsweise der dritten komplementaritätsbestimmenden Regionen, CDR3s.). Legen Sie die DNA – Bibliothek in das PIMD Plasmid (Abbildung 2) unter Verwendung von Standard molekularen Klonierungsverfahren 23. Hinweis: Dieses Plasmid exprimiert scFvs als genetische Fusion an die ssTorA Signalsequenz (N-terminal zu scFv) und dem FLAG-Epitop-Tag (C-terminal an das scFv). Die Konstruktion des Plasmids für die innere Membran Anzeige wurde zuvor 19 beschrieben. Das PIMD Plasmid ist von den Autoren zur Verfügung. <br/> Abbildung 2. Inner-Membran Anzeige Plasmid (PIMD) Karte (Schritte 1.2 bis 1.3). Dieses Plasmid enthält ein lac – Promotor, ColE1 – Replikationsursprung und ein Chloramphenicol – Resistenzgen. Der eingegebene scFv-Gen wird in die ssTorA Signalsequenz fusioniert ist, die scFv an den Tat-Weg zum Ziel und mit einem FLAG-Epitop-Tag, wobei alle drei im gleichen Leserahmen. Restriktionsenzymstellen sind angegeben. Für eine Bibliothek zwischen den XbaI und NotI – Restriktionsenzym – Stellen eingefügt, die Größe des Plasmid ist 2219 bp plus der Größe des scFv. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Wandeln Sie die Plasmid – DNA , die die Bibliothek in MC4100 E. enthält coli – Zellen 23. Erholen und wachsen diese bakterielle Form der Bibliothek. Zentrifuge bei 4000 × g für 15 min bei RT die Zellen zu sammeln. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der gesammelten Zellenin 25% Glycerol in Luria-Bertani (LB) Medium. Shop Aliquots bei -80 ° C, bis sie benötigt, oder gehen Sie zu Schritt 2. HINWEIS: Das Protokoll wurde mit MC4100 – Zellen überprüft worden, obwohl andere E. coli – Stämme sind auch mit dem Protokoll kompatibel sein erwartet. Elektroporation ist das bevorzugte Verfahren für die Transformation, aufgrund seiner hohen Transformationseffizienz. Die Bibliothek sollte typischerweise aus mindestens 10 9 scFv in diesem Stadium Varianten und jedes Aliquot sollte genug Zellen enthalten , so dass die Bibliothek 100fachen bedeckt. 2. Drücken Sie die Bibliothek und vorbereiten Sphäroplasten ein Aliquot der bakteriellen Bibliothek (aus Schritt 1.3) bei RT auftauen, und fügen Sie den aliquoten in einen Kolben mit 100 ml LB-Medium mit 20 ug / ml Chloramphenicol (Cm). Wachsen 3 h bei 37 ° C und 225 rpm in einem Schüttler inkubiert. Nach 3 Stunden, die Kolben aus dem 37 ° C inkubiert Schüttler entfernen. Lassen Sie die Expression der scFv-BibliothekO / N für 15 bis 22 Stunden bei 20 ° C und 225 rpm in einem Schüttler inkubiert fortzufahren. HINWEIS: Kein Induktor benötigt wird, wenn das PIMD Plasmid verwenden, da der Promotor undicht ist. Beachten Sie, dass MC4100 Zellen überexprimiert nicht den Lac-Repressor (und LacI nicht auf dem Plasmid gefunden). Abbildung 3. E. coli – Zellen und Sphäroplasten. (A) E. coli – Zellen sind von zylindrischer Form. (B) Nach Spheroplasting EDTA und Lysozym unter Verwendung der äußeren Membran des E. coli Zellen wird aufgebrochen, und die erhaltenen Sphäroplasten sind kugelförmig. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie – Aufnahmen wurden mit einem 100x Objektiv auf einem inversen Mikroskop erhalten. Bitte clecken hier eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bereiten Sie die Bibliothek Sphäroplasten. HINWEIS: Die Sphäroplasten werden durch Zerreißen der äußeren Membran von E. gebildet coli und sind kugelförmig (Figur 3). Bereiten Sie die erforderlichen Puffer. HINWEIS: Alle Puffer sollten steril sein. Vorbereitung 1 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; pH 7,4) durch Auflösen von 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 in destilliertem H 2 O auf ein Endvolumen von 1000 ml. Halten Sie sich auf dem Eis. Bereiten PBS mit 0,1% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA) durch Auflösen von 0,2 g BSA in 200 ml 1 × PBS. Halten Sie sich auf dem Eis. Bereiten Sie die Fraktionierung Puffer (FB) um 7,5 ml sterilfiltrierter 1 M Saccharose, 1 ml 1 M Tris – Puffer (pH 8,0) vermischt und 1,5 ml destilliertem H 2 O. Halten Sie sich auf dem Eis. Vorbereitung 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) durch Zugabe von 30 & mgr; l of 0,5 M EDTA zu 14,97 ml destilliertem H 2 O. Bereiten 0,5 M MgCl 2 von 4,76 g MgCl 2 in 100 ml Lösen von H 2 O destilliert Halten Sie sich auf dem Eis. Entfernen Sie den Kolben aus dem Schüttler, und messen die optische Dichte (OD) bei 600 nm mit einem Spektralphotometer der Zelldichte zu bestimmen. Berechne das Volumen der induzierten Kultur benötigt , so dass jede Probe für Spheroplasting 1 × 10 10 Zellen hat. HINWEIS: Die Annäherung einer OD 600 von 1 mit einer Konzentration von 10 9 Zellen / ml für E. anzeigt , coli 24 können verwendet werden. Zentrifuge das berechnete Volumen der induzierten Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 12000 × g bei RT für 5 min. Bereiten Sie mindestens zwei Proben in dem Fall, dass ein Problem bei der Probenvorbereitung entsteht. Entfernen Sie den Überstand von den zentrifugiert Kulturen und resuspendieren jedes Zellpellet in 100 ul eiskaltem FB. Zentrifuge bei 12.000 ×g bei RT für 1 min, und anschließend den Überstand mit einer Pipette entfernt werden. Resuspendieren jedes Pellet in 350 ul eiskaltem FB ergänzt mit 3,5 ul 10 mg / ml Lysozym. Langsam jedes Röhrchen verwirbeln, während die Zugabe tropfenweise 700 ul 1 mM EDTA, und dann für 20 min die Röhrchen bei RT inkubieren, während langsam auf einem Rohr rotierenden Rotator um die Proben zu mischen. Entfernen Sie die Schläuche aus dem Rotator, fügen Sie 50 ul eiskaltem 0,5 M MgCl 2 in jedes Röhrchen und brüten sie auf Eis für 10 min. Zentrifuge die Röhrchen bei 11.000 × g bei 4 ° C für 10 min. Isolieren Sie die Sphäroplast Pellet. Verwenden Sie einen Mikro mit einer 1 ml-Spitze zu langsam Teil des Pellet nach oben ziehen. in einem Winkel mit der Öffnung direkt über ein neues 1,5-ml-Röhrchen, heben Sie langsam die Pipettenspitze aus dem Überstand, während das Rohr halten und das Pellet in das neue Rohr schieben. Wenn ein signifikantes Volumen an Überstand auf das neue Rohr übertragen wird, entfernen Sie sie durch Pipettieren. Wenn das Pellet nicht fest ist enoigitt zu übertragen, Wieder Zentrifuge bei 11.000 × g für 2 min und Versuch Pellet Isolation wieder. Resuspendieren Sphäroplast Pellet in jedem Röhrchen in 1 ml eiskaltem 1 × PBS. Wechseln Sie zwischen Pipettieren und langsam verwirbelt auf einem Vortex-Halter, bis das Pellet vollständig suspendiert ist. Bewahren Sie keine Proben für mehr als 2 min zu einer Zeit des Eises ab und kehren zum Eis für mindestens 5 min, bevor er wieder aus dem Eis zu entfernen. Halten Sie die Sphäroplasten bei 4 ° C (für bis zu 2 Tage) bis zum Schwenken in Schritt 4 verwendet. 3. Unbeweglichkeitseffekt das Ziel-Antigen auf Magnetic Beads Biotinylierung das Zielantigen in vivo während der rekombinanten Produktion in E. coli – Zellen. Alternativ chemische Konjugation 25 oder Kauf Zielantigen verwenden , die bereits biotinyliert wurde, und fahren 3.2 zu Schritt. In 816 g Bicin bis 50 ml Wasser auf 10 × Bicin Puffer zu machen. Verdünnen Sie die buffer bis 1 × in destilliertem H 2 O und Wärme auf 50 ° C. In 14,7 mg Biotin bis 12 ml des erwärmten 1 × Bicin Puffer eine Biotin-Lösung zu machen, die 5 mM Biotin in 10 mM Bicin Puffer ist. Lagerung bei -20 ° C bis benötigt. Auszudrücken und Biotinylierung des Zielproteins mit Hilfe des pAK400cb-BCCP Plasmid 26, die die Produktion des Zielantigens als eine Fusion an das Biotin – Carboxyl – Carrier – Protein (BCCP) ermöglicht. HINWEIS: E. coli – Zellen nativ biotinylieren BCCP, entfällt die Notwendigkeit zu reinigen und chemisch das Zielprotein vor der Immobilisierung auf mit Streptavidin beschichteten Kügelchen biotinylieren. Die native E. coli Biotin – Ligase BirA ist ausreichend zur Biotinylierung des Fusionsproteins. Wachsen E. coli , enthaltend das Biotinylierung Plasmid (mit der als eine Fusion an den N-Terminus von BCCP eingefügt Zielantigen) O / N für 15 bis 18 Stunden in 5 ml LB – Medium mit 20 ug / ml Cm bei 37 ° C ergänzt unter Schütteln bei 225 Upm. Messen Sie die OD bei 600 nm mit einem Spektralphotometer und berechnen das Volumen der Kultur benötigt (V) In den Subkultur zu einem Ausgangs – OD von 0,05 in 25 ml frischem LB – Medium mit 20 ug / ml Cm unter Verwendung der Gleichung: V add = (0,05 × 25 ml) / (OD 600 bis 0,05), wobei OD 600 ist die optische Dichte des O / N – Kultur und V hinzuzufügen , ist das Volumen des O / N – Kultur auf die frische LB. hinzuzufügen Subkultur und auf eine OD von 0,5 bis 0,8 in einem Schüttler inkubiert bei 37 ° C und 225 UpM wachsen. Hinzufügen Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid bis zu einer Endkonzentration von 100 uM und Biotin bis zu einer Endkonzentration von 5 uM. Induzieren die Expression in einer Schüttelvorrichtung inkubiert 15 bis 22 Stunden bei 20 ° C und 225 Umdrehungen pro Minute. Ernte Bakterien durch Zentrifugation bei 4.000 × g bei 4 ° C für 10 min. Entfernen Sie den Überstand. Lagern Sie das Pellet bei -20 ° C bis zur Verwendung. Hinzufügen1 ml einer Zelllyse Waschmittels pro 0,2 g Zellpellet. Resuspendieren durch Pipettieren und drehen sanft für 20 Minuten um die Zellen zu lysieren. Nach der Lyse Zentrifuge bei 16.000 × g und 4 ° C für 20 min. Pipette das lösliche Lysat (Überstand) in ein neues 1,5-ml-Röhrchen. Verwenden Sie ein 3 kDa Molekulargewichtsgrenze Säule des ungebundenen Biotin zu entfernen. Pipettieren des Lysats in die Säule und zentrifugieren bei 20 ° C gemäß den Anweisungen des Herstellers. Waschen mit 1 × PBS, bis das Biotin in dem Lysat wurde 100-fach und das Volumen des gewaschenen Lysat wird auf das ursprüngliche Volumen des Lysats gleich verdünnt worden. Transfer des Lysats in ein neues Röhrchen. Immobilisieren das biotinylierte Zielantigen auf Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. Vorbereitung 1 × PBS und 1 × PBS mit 0,1% (w / v) BSA, wie in Schritt 2.3.1 beschrieben. Bereiten Sie die magnetischen Kügelchen. ANMERKUNG: Dies erfordert die Verwendung einer magnetischen Trennständer. resuspendieren streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen in ihrer Originalflasche. Entweder Wirbel für mindestens 30 Sekunden oder drehen 5 min. Übertragen 7-10 × 10 9 Kügelchen in ein 1,5 – ml – Röhrchen. HINWEIS: Das erforderliche Volumen wird auf der Perlenkonzentration vom Hersteller geliefert, abhängig sein. Das Röhrchen wird die Perlen auf dem Magnetträger für 2 min mit den Perlen auf der Seite des Röhrchens zu sammeln. Mit dem Rohr noch auf dem Magneten, entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch Pipettieren ohne die Perlen zu stören. Zum Waschen entfernen Sie den Schlauch aus dem Magneten und resuspendieren die Perlen in 1 ml 1 × PBS durch Pipettieren ohne Blasen zu erzeugen. Bringen Sie das Rohr zum Magneten für 2 min die Perlen zu sammeln, und den Überstand vorsichtig entfernen durch Pipettieren. Den Vorgang wiederholen zwei weitere Male für insgesamt drei Waschungen. Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit in dem Rohr nach dem letzten Waschschritt bleibt. Fügen Sie das Lysat des biotinylierten Antigens an den magnetischen bea enthältds. Entfernen des Rohres aus dem Magneten und Resuspendieren der Kügelchen in 1 ml des Lysats (aus Schritt 3.1.5). für 30 Minuten bei RT inkubieren, während sanft drehen. Das Röhrchen wird auf dem Magneten 3 min die Antigen-beschichteten Perlen zu sammeln. Waschen der beschichteten Kügelchen fünfmal mit 1 × PBS mit 0,1% BSA auf die gleiche Weise wie in den Schritten 3.2.2.3 bis 3.2.2.4 beschrieben. Nach dem letzten Waschen, Resuspendieren der Kügelchen in 1 × PBS mit 0,1% BSA up Volumen derselben in Schritt 3.2.2.2 verwendet. Wenn das immobilisierte Ziel-Antigen bei 4 ° C stabil ist, lagern die beschichteten Kügelchen bei 4 ° C bis zum Schwenken erforderlich ist. Andernfalls gehen Sie zu Schritt 4. 4. Bildschirm die scFv-Bibliothek durch Panning gegen das Zielantigen (Abbildung 4) Abbildung 4. Schwenken (Schritt 4). Antigen-beschichteten magnetischen Kügelchen are mit Sphäroplasten exprimieren Antikörper-Bibliothek Varianten inkubiert. Plasmid DNA aus Kügelchen gebundenen Sphäroplasten wird zurückgewonnen und verwendet, um eine Subbibliothek zu erzeugen, die die ELISA-basierten sekundäre Sieb gesiebt verwendet. Entsprechende Protokollschritte werden zur Kenntnis genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Inkubieren der beschichteten Kügelchen mit Sphäroplasten. Verwenden Sie ein Sphäroplast zum Auffädeln Verhältnis von etwa 5: 1. In 4 × 10 9 Sphäroplasten und 8 × 10 8 Kügelchen in ein steriles 15 ml Röhrchen. HINWEIS: Es sei angenommen , daß keine Zellen während des Spheroplasting verloren wurden, so dass die Konzentration noch 1 × 10 10 Sphäroplasten / ml ist. 1 × PBS mit 0,1% BSA das Gesamtvolumen auf 4 ml zu bringen. Aliquot in vier 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml. Inkubieren der Reaktion bei 4 ° C für 5 Stunden unter leichtem Drehen. Prepare die Kügelchen gebundenen Sphäroplasten für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Legen Sie die Panning Reaktionsrohre auf dem Magneten 3 min. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und wäscht die Sicke gebundenen Sphäroplasten viermal mit eiskaltem 1 × PBS mit 0,1% BSA auf die gleiche Weise wie in den Schritten 3.2.2.3 bis 3.2.2.4 beschrieben. Resuspendieren der Kügelchen gebundenen Sphäroplasten in jedem Röhrchen in 25 ul destilliertem H 2 O. Lagern Sie die Perlen bei -20 ° C oder gehen 4.3 zu Schritt. Führen Ganz Plasmid PCR an Kügelchen gebundenen Sphäroplasten die Plasmide zu amplifizieren, die die Gene für die Kügelchen gebundenen scFvs enthält. Erhalten Primer mit den folgenden Sequenzen: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 '(Forward-Primer) und 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3' (Reverse-Primer). ANMERKUNG: Diese werden Ende-zu-Ende binden an entgegengesetzten Strängen des Plasmids PIMD (Figur 2) und sind mit einem gemeinsamen Merkmal PIMD zu tempern ausgelegt, so wird Amplifikation auftreten , unabhängig von derscFv Variantensequenz. Phosphorylieren der Primer. Anmerkung: Ohne Phosphorylierung, Religation wird nicht auftreten. Primer können auch mit 5'-Phosphorylierung bestellt werden, anstatt diese Phosphorylierung Verfahren in diesem Protokoll. In einer 0,5 – ml – Röhrchen, eine Phosphorylierungsreaktion für die Vorwärts – PCR – Primer aufgebaut , wie in Tabelle 1 beschrieben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Reverse – Primer. Inkubiere die Reaktionen bei 37 ° C für 1 Stunde. Dann inkubieren bei 65 ° C für 20 min, um die T4-Polynukleotidkinase (PNK) zu deaktivieren. Lagern Sie die phosphorylierte Primer bei -20 ° C. Führen Sie die PCR. In einem PCR – Röhrchen, bereiten die PCR – Reaktion wie in Tabelle 2 beschrieben. HINWEIS: Mehrere Reaktionen können für eine höhere Ausbeute hergestellt werden. Die nicht verwendeten Kügelchen gebundenen Sphäroplasten kann bei -20 ° C gelagert werden. Erhitzen Sie die PCR-Reaktionen bei 98 ° C für 15 min in einem Thermocycler vollständige Lyse sicherzustellen der Sphäroplasten. Entferne die Röhrchen aus dem Thermocycler und mit 0,5 ul einer High-Fidelity-Polymerase zu jedem. Rücklaufrohre zu den Thermocycler und starten Sie das Programm mit detaillierten in Tabelle 3. Pool der PCR-Produkte als angemessen. Lagerung bei -20 ° C oder gehen 4.4 zu Schritt. Tabelle 1 PNK Phosphorylierungsreaktion (Schritt 4.3.2.1). Reagens Volumen (ul) Destilliertes H 2 O 15 10x T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer 2 100 & mgr; M Primer 2 T4-Polynukleotidkinase (PNK) 1 ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-mit-next.within-page =" always "> Tabelle 2. Whole-Plasmid PCR – Reaktion (Schritt 4.3.3.1). Reagens Volumen (ul) Destilliertes H 2 O 28.5 5x High-fidelity-Polymerase-Puffer 10 10 & mgr; M Phosphorylated Vorwärtsprimer 2.5 10 & mgr; M Phosphorylated Reverse-Primer 2.5 40 mM dNTP-Mix (10 mM jedes dNTP) 1 Bead-gebundene Sphäroplasten 5 Tabelle 3. PCR – Programm (Schritt 4.3.3.2). <tbody> Schritt Temperatur (° C) Zeit (min: sek) Anzahl der Zyklen Initial denaturieren 98 0.30 1 Denaturieren 98 00.10 35 Glühen 69 0.30 Erweiterung 72 0.30 pro kb Endgültige Verlängerung 72 06.00 1 Halten 12 Unendlich 1 Re-circularize die ganze-Plasmid PCR – Produkte, und verwenden Sie das ligierte Produkt MC4100 E. zu transformieren coli – Zellen. Man reinige das PCR – Produkt von der PCR – Reaktion läuft auf einem Agarosegel 23, Anfärben der DNA in dem Gel 23 und unter Verwendung einerGel Cleanup Kit das linearisierte Plasmid gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen. Messen Sie die Konzentration eines Spektrophotometers bei 260 nm verwendet wird. Lagern Sie das gereinigte Fragment bei -20 ° C bis sie benötigt werden, oder weiter 4.4.2 Schritt. Re-circularize Plasmid aus dem PCR-Produkt. Um zu verhindern , intermolekulare Ligation des PCR – Produkts, Durchführung der Ligationsreaktion mit einer niedrigen Konzentration von 27 1 ng / & mgr; l des PCR – Produktes. Berechnen Sie das Volumen benötigt zur Herstellung eines 800 & mgr; l Ligationsreaktion bei dieser Konzentration. Bereiten Sie die Ligatur Reaktion auf Eis. In einem Rohr, fügen Sie die in Schritt 4.4.2.1 des PCR – Produkts berechnet Volumen, 80 & mgr; l von 10 × DNA – Ligase – Puffer und destilliertem H 2 O bis zu 800 & mgr; l. Hinzufügen, 4 ul T4 DNA Ligase und sofort Die Röhrchen bei 16 ° C in einem Wasserbad oder Thermocycler. Inkubieren bei 16 ° CO / N für 14 bis 18 Stunden. Speichern Sie die fertigen Ligasierungsreaktionen bei -20 ° Cbis sie benötigt werden, oder gehen Sie 4.4.3 Schritt. Platzieren Sie die Ligationsreaktion auf einem Heizblock bei 65 ° C für 15 Minuten, um die DNA-Ligase wärme inaktivieren. Dann verwenden Sie eine Mikrodialyse- Membran oder DNA-Cleanup-Kit, um de-Salz mit der ligierten DNA. Lagern bei 20 ° C oder gehen 4.4.4 zu Schritt. Verwenden Sie die gesamte hitzeinaktiviertem, de-gesalzen Ligierungsproduktes MC4100 E. zu transformieren coli – Zellen 23. Bereiten Glycerinstamm, wie in Schritt 1.3, der Zellen enthält, die sich ergebende ausgewaschen Subbibliothek beschrieben und speichern Aliquots bei -80 ° C. Wiederholen Sie Schritt 4 in seiner Gesamtheit eine aliquote Menge von Schritt 4.4.4 unter Verwendung eines zweiten Panning auf der Unterbibliothek zu tun. HINWEIS: Eine zweite Panning hilft für Bibliothek Bestandteile bereichern , die gut an das Ziel – Antigen 19 binden. 5. Führen Sie einen zweiten Bildschirm unter Verwendung eines Enzym-Immunoassay-Methode viel versprechende Klone zu identifizieren, für die weitere Charakterisierung (Abbildung 5) </P> Abbildung 5 : ELISA-basierten Sekundärscreening (Schritt 5). (A) Bibliothek Varianten aus der Unterbibliothek während Panning angereichert werden in einzelnen Vertiefungen einer Kulturplatte für das Wachstum und die Expression inokuliert. (B) Eine ELISA – Platte wird mit dem Zielantigen beschichtet. (C) Die Bibliothek Varianten werden unter Verwendung des ELISA-basierten sekundären Bildschirm im Protokoll beschrieben gescreent. Bei der Analyse der Daten aus dem sekundären Bildschirm erhalten, Varianten von Interesse ausgewählt und weiter gekennzeichnet. Entsprechende Protokollschritte werden zur Kenntnis genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Tauen ein Rohr der verrissen Subbibliothek (aus Schritt 4.4.4) und Platte auf LB-Agar-Platten. Platte mehrere Verdünnungenbei Konzentrationen niedrig genug einzelne Kolonien zu gewährleisten (beispielsweise 10 2 – bis 10 6 -fachen Verdünnungen). Inkubieren der Platten für 15 bis 18 Stunden bei 37 ° C. Lagern Sie die Platten bei 4 ° C oder gehen 5.2 zu Schritt. Kultur und induzieren Kolonien von der verrissen Subbibliothek. Führen Sie alle Schritte unter sterilen Bedingungen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette für die Schritte 96-Well-Platten beteiligt sind. In 200 ul LB mit 20 ug / ml Cm in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Kulturplatte. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Agarplatte mit einer Pipettenspitze, legen Sie die Spitze in der ersten Vertiefung der 96-Well-Platte, und sanft rühren zu impfen. Verwenden Sie für jede Vertiefung eine neue Spitze. eine Kolonie in jede Vertiefung impfen. Als Kontrolle mindestens ein Sterilitätskontrolle gut keine Kolonie inokuliert. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1 und 5.2.2 bis zu mehreren 96-Well-Platten impfen. Legen Sie die 96-Well-Platten auf einem Schüttler bei 310 Umdrehungen pro Minute. Inkubieren bei 376; C für 20 bis 24 Stunden die scFvs auszudrücken. Für jede Kulturplatte in Stufe 5.2, Mantel einer 96-Well-ELISA-Platte mit dem Zielantigen. Verdünnter gereinigter Zielantigen zu einer geeigneten Konzentration (beispielsweise 1 & mgr; g / ml bis 4 & mgr; g / ml) in 1 × PBS um die Beschichtungslösung herzustellen. Machen Sie 5 ml Beschichtungslösung für jede 96-Well-Platte. Hinweis: Die entsprechende Konzentration auf das spezifische Antigen hängt verwendet und muss unter Umständen angepasst werden. In 50 ul der Beschichtungslösung zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Hoch Bindung klarem Polystyrol-ELISA-Platte. Klopfen Sie leicht die Platte an der Benchtop-Oberfläche, dass die gesamte Oberfläche jedes gut gewährleistet ist, beschichtet. Wiederholen Sie für jede Platte. Inkubiere die Platten bei 4 ° CO / N. Replizieren Sie die Kolonien, die aus den 96-Well-Kulturplatten auf Agarplatten. Legen Sie eine sterile Polystyrol-Replikator in die Vertiefungen einer Kulturplatte eine kleine Menge von Liqu zu sammelnIch würde. Sorgfältig den Replikator erhöhen und so zu einer 15 cm LB-Agar-Platte übertragen, dass alle Tipps, um die Platte berühren. Sobald die Flüssigkeit übertragen hat, heben Sie gerade nach oben den Replikator. Wiederholen Sie für jede Kulturplatte. Beschriften Sie die Agar-Platte mit der richtigen Ausrichtung, so dass die Ergebnisse aus dem sekundären Bildschirm im 96-Well-Platte kann mit der richtigen replizierten Kolonie auf der Platte angepasst werden, wenn die weitere Charakterisierung erwünscht ist. Wachsen bei 37 ° C für 15 bis 18 Stunden, und dann bei 4 ° C lagern, bis sie gebraucht. Führen Sie den ELISA sekundären Bildschirm. Bereiten Sie die Blockierungslösung von 2% zu machen (w / v) Trockenmilch in 1 × PBS. Entleeren der Beschichtungslösung aus den ELISA-Platten. Füge 100 ul der Blockierungslösung in jede Vertiefung. mindestens 2 Stunden bei RT inkubieren oder Block O / N bei 4 ° C. Vorbereitung der Waschpuffer durch Polysorbat 20 bis zu einer Endkonzentration von 0,05% in 1 × PBS hinzugefügt wird. Stellen Sie 250 ml pro ELISA-Platte. In 20 ul einerkonzentrierte Waschmittel Zelllyse zu jeder Vertiefung der Rundboden-Kulturplatte, und die auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler Kulturplatte für 15 bis 20 min bei RT inkubiert. Beginnen die Lyse zur gleichen Zeit, dass die Blockierung der ELISA Platten abgeschlossen ist, so dass die Lyse und Waschschritt 5.5.4 gleichzeitig durchgeführt werden können. Leeren Sie den Blockierungslösung aus den ELISA-Platten. Waschen Sie die blockierten ELISA-Platten viermal mit 200 ul Waschpuffer pro Vertiefung pro Wäsche. Leeren Sie den Waschpuffer aus den Vertiefungen. Dann werden 50 & mgr; l aus jeder Vertiefung der Platte Zelllyse die Vertiefung der ELISA-Platte entspricht, eine neue Spitze für jede Vertiefung verwenden. Inkubiere die ELISA-Platte bei RT für 1 bis 2 h. Bereiten Sie die Antikörperlösung zu gebundenen scFvs erkennen. Verwenden, um eine Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem primären Antikörper, der in die Bibliothek scFvs fusioniert an die FLAG-Epitop-Tag bindet. Verdünnen Sie die Antikörper an die entsprechende Verdünnung in einem ELISA zu verwenden (siehe Zulieferer & #39; s Empfehlungen) in 2% (w / v) Trockenmilch in 0,05% Polysorbat 20 in 1 × PBS. Bereiten Sie 5 ml für jede Platte. Waschen Sie die ELISA-Platten viermal mit Waschpuffer wie in Schritt 5.5.4 beschrieben. Je 50 ul der Antikörperlösung zu jeder Vertiefung der ELISA-Platte. Inkubieren für 1 bis 2 h bei RT. Bereiten Sie das HRP – Substrat durch Auflösen von o – Phenylendiamin (OPD) -Tabletten in destilliertem H 2 O pro Protokoll des Herstellers während Licht zu vermeiden. Es werden 20 ml pro ELISA-Platte. Vorbereitung 3 MH 2 SO 4 durch konzentrierte H 2 SO 4 mit destilliertem H 2 O wie erforderlich verdünnt. Bereiten Sie 5 ml pro ELISA-Platte. Achtung: H 2 SO 4 ist eine starke Säure. Achten Sie darauf, geeignete persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Waschen Sie die ELISA-Platten viermal mit Waschpuffer, wie in Schritt 5.5.4 beschrieben. Inkubieren ELISA-Platten mit dem HRP Substrate. In 200 ul des HRP-Substrat in jede Vertiefung. Zur Minimierung der Belichtung, fügen Sie das Substrat auf eine ELISA-Platte zu einem Zeitpunkt, und wickeln mit Aluminiumfolie, bevor zum nächsten Platte fortfahren. Inkubieren der Platten für 30 bis 60 min bei RT im Dunkeln. Nach der ersten 30 Minuten, überprüfen Sie die Platten für die des Substrats Verdunkelung und brüten mehr Farbe sichtbar zu machen, wenn nötig zu entwickeln. Je 50 ul 3 MH 2 SO 4 in jede Vertiefung die Reaktion zu quenchen. Mit einer anderen Tipp für jede Vertiefung, mischen Sie die Lösung in den Vertiefungen durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten ohne Aufschäumen. Aus Gründen der Einheitlichkeit und der Sättigung zu verhindern, fügen die H 2 SO 4 schnell und sorgfältig auf alle der ELISA – Platten vor , die Lösung für jede Platte zu mischen. Messen der Extinktion der Lösung in den Vertiefungen jeder Platte bei 492 nm einen Plattenleser. Analysieren Sie die Absorptionsdaten zu identifizieren scFv-Varianten, die exhibes vielversprechende Bindungssignale und diese vielversprechenden scFvs charakterisieren. Wählen scFvs, die Absorptionssignale höher als das Hintergrundsignal und höher als die durchschnittliche Signal auf jeder Platte aufweisen. HINWEIS: Die Absorptionsstufe wird auf die Eigenschaften des Antigens und anti-FLAG-Antikörper verwendet, zusammen mit der Stärke der scFv Varianten abhängig sein, die in dem Screening isoliert.