Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
L'angiogénèse est déclenchée par des signaux de signalisation extracellulaire qui favorisent les cellules endothéliales (EC) pour polariser la migration directionnelle avec une spécificité et de former de nouveaux vaisseaux dans les tissus qui nécessitent une alimentation en sang. Les facteurs contributifs pensé à conduire l'angiogenèse sont des signaux à partir de la matrice extracellulaire (ECM). En réponse à des signaux physiques, CEs étendre de nouvelles branches avec une spécificité directionnelle pour guider le mouvement directionnel dans la formation du 1,2 du réseau vasculaire. L'architecture de la morphologie CE et ramification est défini par la réglementation localisée du cytosquelette de microtubules (MT) d'une manière qui est coordonnée avec la réglementation des acto-myosine contractilité 3. Pour les branches CE pour former, myosine-II doit être downregulated localement, ce qui entraîne des protubérances membranaires localisées 4. Dans le même temps et au même endroit dans la cellule, la dynamique de croissance MT se modifient résultant de la croissance de MT lente et persistante de promouvoir la branche elontion et de la stabilité 5. Ce règlement cytosquelette coordonné permet ECs de polariser leur morphologie pour faciliter la migration directionnelle.
Le développement d'une morphologie cellulaire polarisée monter MT polarisée 6. Dans la migration des cellules épithéliales, MTs se développent lentement et de façon persistante spécifiquement à la fine pointe de la cellule 7-9; tandis que dans les neurones, l'initiation et de l' allongement des axones ou dendrites exige que MTs sont non seulement présents, mais qu'ils subissent dynamiquement les processus de montage et de démontage 10-15. De cette façon, le contrôle localisé de la dynamique de croissance MT détermine l'architecture de la cellule et permet un remodelage rapide de la morphologie des cellules comme CEs naviguer à travers leur ECM.
la dynamique de croissance MT sont réglementées par des familles de protéines motrices moléculaires et des protéines non-motrices, appelées microtubules Associated Proteins ou microtubules protéines interagissant (désormais réféRRED comme MAPs). Les cartes peuvent être activées localement ou inactivé, généralement par des cascades initiées à l'interface cellule-ECM 16,17 signalisation. Fonction Une fois activé, MAPs en se liant à la MT et de modifier la cinétique de MT montage et le démontage; fonctionnant ainsi de réguler localement la dynamique MT afin de promouvoir la forme des cellules et de la polarité 18-20. Mitotique Centromere Associated Kinesin (MCAK) est un MAP Kinesin-13 famille qui se lie aux extrémités et les couples d'hydrolyse de l' ATP à MT désassemblage 21-23 MT. Ce rôle fonctionnel de MCAK est connue pour être critique dans le fuseau mitotique 24-28, ainsi que pendant l' interphase 29,30. Dans interphase CEs, MCAK médiée MT désassemblage est régulée par localisée Aurora-A phosphorylation induite par des MCAK en réponse à remontage bord activation induite de la petite GTPase Rac1. Le résultat de cette cascade de signalisation est l'inhibition de MCAK à la fine pointe de la COCOM, entraînant une croissance de MT polarisée vers le leading bord et induits MCAK-MT désassemblage au niveau du bord de fuite de la migration 31 CEs.
méthodes traditionnelles de mesure de la dynamique de croissance MT ont généralement utilisé le suivi de la main de l'une ou l'autre tubuline marqué par fluorescence ou, plus récemment, marqué par fluorescence MT Fin protéine de liaison 1 ou 3 (EB1 ou EB3, respectivement). L'approche de la tubuline fluorescente a l'avantage d'étiqueter l'ensemble du réseau de MT. Cependant, comme la plupart des types de cellules mitotiques à maintenir un réseau radial de MTs pendant l' interphase 8,32,33, MTs près du centrosome sont très denses, et en conséquence, le suivi de l' évolution de la MT et le démontage avec la tubuline fluorescente est généralement limitée à la périphérie des régions de la cellule. En raison de ces limitations, l'utilisation des protéines EB marquées par fluorescence (EB1 ou EB3) a été l'approche plus commune pour mesurer la dynamique de MT. Parce que EBs seule l'étiquette les plus-extrémités croissantes de MTs, ils apparaissent comme de petite taille (1-3 pm), fluorescent brillamment venirts, fournissant ainsi un marqueur facilement discernable de polymérisation MT avec un fond très limité fluorescence 34-37. Bien que le fait que l'étiquette EB seulement un sous-ensemble du réseau MT représente un atout majeur de l'approche EB, il met également en évidence une limitation importante, que les MTs non-croissance ne sont pas marqués par l'approche de EB3. Néanmoins, la capacité de mesurer et de suivre les comètes EB3 au fil du temps et de visualiser la croissance MT dans les régions sub-cellulaires font de cette approche idéale pour les applications qui nécessitent une évaluation régionale de l'organisation MT.
Une autre limitation critique des méthodes traditionnelles de mesure dynamique de croissance MT a été très grands ensembles de données et le temps nécessaire à l'analyse des données. Cette limitation découle de la nécessité pour le suivi de la main de centaines de comètes EB à haute résolution temporelle. En outre, ces mesures doivent être effectuées dans un nombre statistiquement significatif de cellules et également réalisée sous une variété de contrôle et experimeconditions NTAL. Récemment, ces contraintes ont été surmontées grâce à des techniques d'analyse de calcul spécifiquement destinés aux comètes suivi EB3 utilisant la microscopie time-lapse dans les cellules vivantes 35. Lorsqu'il est utilisé de manière appropriée, cette approche de calcul sert à la fois de restreindre les possibilités d'erreur humaine associée à la main suivi en plus de fournir une méthode à haut débit de mesure polymérisation MT. Analyse computationnelle de la dynamique MT en utilisant le progiciel basé sur MatLab, plusTipTracker, permet des mesures de croissance MT par le suivi des comètes EB3 marqués par fluorescence 5,31,35,38. En outre, le logiciel plusTipTracker permet de calculer des événements catastrophiques MT (aka démontage) basé sur la disparition des comètes EB3 dans une piste de MT de plus en plus, et permet une analyse sub-cellulaire (aka régionale) de la dynamique de croissance MT dans les régions définies par l' utilisateur d'intérêt . Pour nos études, la dynamique de croissance MT ont été comparés dans lesrégions ramifiées par rapport à des régions non-ramifiés, ou dans menant contre les bords de fuite des cellules. La sortie de données à partir du logiciel plusTipTracker peut également être utilisé pour générer des superpositions de piste à code couleur pour les cellules individuelles et les régions sub-cellulaires.
Nous décrivons ici la méthodologie utilisée pour étudier le rôle de MCAK dans la modulation de la dynamique de croissance de MT et la contribution de ce MT dépolymérase à la réglementation des CE ramification morphologie et migration directionnelle. Notre approche a utilisé une première ligne de cellules humaines, des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui sont faciles à cultiver et se prêtent très bien à induit électroporation, transfection transitoire du plasmide d'ADNc. Nous avons ensuite utilisé à haute résolution, time-lapse de microscopie par fluorescence de HUVEC transfectées avec MT End Binding Protein 3 (EB3) et mitotique Centromere Associated Kinesin (MCAK) ADNc spécifique de constructions pour évaluer les effets sur la dynamique MT transfectées HUVEC. analyse d'image de calcul basée sur PlusTipTracker de EB3MT, plus marqué au extrémités était de mesurer la vitesse de croissance MT et la durée de vie de croissance MT dans les images en accéléré, de mesurer et de comparer les effets des manipulations expérimentales sur la dynamique de croissance MT. Cette méthodologie permet l'étude de la dynamique MT et l'identification de la façon dont la régulation localisée de la dynamique MT dans les régions sous-cellulaires contribue aux processus angiogéniques des CE de ramification et de la migration. Ces techniques sont applicables aux enquêtes de toute carte qui peuvent être marquées par fluorescence et exprimés dans les cellules vivantes.
Utilisation de HUVEC en Morphologie et migration expériences.
imagerie des cellules vivantes de la dynamique de croissance de MT EB3 marqué au sein de HUVEC nécessite des conditions de culture cellulaire appropriés et reproductibles afin de mesurer et d'évaluer les changements dans la croissance MT et HUVEC morphologie, de telle sorte qu'ils peuvent être affectés à une signalisation de la MEC cue. HUVEC représentent un excellent modèle pour l'étude de la forme des cellules et la motilité. Ils sont extrêmement sensibles à la transfection avec des ADNc marquées par fluorescence, ils présentent des morphologies dramatiques en réponse aux deux signaux de signalisation solubles et physiques, et ils maintiennent la capacité à s'organiser dans des tubes vasculaires lorsqu'ils bénéficient de conditions de culture de cellules appropriées 65-70. des cultures de cellules primaires, telles que HUVEC, nécessitent un traitement et le suivi du numéro de passage cellulaire prudent afin d'assurer que les cellules sont en bonne santé et qu'ils se comportent normalement lors de l'expérimentation. Par exemple, lors d'expériences portant sur l'cytoskeletonne et / ou la morphologie des cellules, des cellules HUVEC ne doivent pas être utilisés pour des expériences au-delà du dixième passage de la culture cellulaire, comme HUVEC commencent généralement à afficher des morphologies non uniformes autour de passage de douze à quinze.
La densité cellulaire est également un régulateur essentiel de la santé et de la prolifération HUVEC. enquêtes de branchement HUVEC (voir Protocole 10.01 à 10.04, ci-dessus) utilisent des cultures de densité relativement faible de la cellule afin de fournir les cellules d'espace physique pour interagir avec leur ECM et d'étendre les saillies ramifiées. En revanche, dans les études de migration plaie de pointe (voir Protocole 10/05 au 10/08), les HUVEC sont la culture en monocouche avant la blessure. En tant que tel, HUVEC blessure pointe affichent une morphologie relativement non-ramifié, étendre menant des saillies de bord, et présentent des interactions cellule-cellule avec leurs voisins immédiats comme ils migrent dans la plaie.
Mises en garde et avantages de suivi MT Dynamics dans Living HUVEC.
Spinning microscopie disque est une excellente approche pourtester des hypothèses expérimentales qui nécessitent image confocale clarté haute résolution temporelle. Avec le module de caméra et laser approprié, cette approche de microscopie est sensible à une faible émission de fluorescence et peut aider à photoblanchiment réduite par rapport à d'autres types de microscopie à fluorescence. Fait important, cette approche est également bien adapté à modéré à élevé résolution temporelle imagerie est nécessaire pour générer des mesures complètes de la dynamique de croissance MT en utilisant l'approche de l'étiquetage EB3, dans une variété de différents types de cellules.
Bien que la méthodologie de EB3 de l'étiquetage croissante MT plus-extrémités présente des avantages distincts par rapport à d'autres méthodes d'étiquetage par fluorescence MTs, elle a aussi des inconvénients uniques. Par exemple, il y a une partie de la gamme MT qui ne sont pas en croissance active à un moment donné, y compris à la fois la population de MTs désassemblage et la population de stabile, MTs non dynamiques 71-74. EB3 ne serait pas étiqueter ces deux populations de MTs etdonc la contribution de ces deux populations ne serait pas inclus dans l'analyse des données expérimentales. méthodes alternatives pour l'évaluation de l'ensemble du réseau de MT ont mis l'accent sur l'expression de la tubuline marquée par fluorescence, qui incorpore dans toutes les populations de MTs et permet l'identification de plus en plus, le rétrécissement, et stabile MTs. Cependant, en raison de la densité relativement élevée de la matrice MT près du centre de la cellule et à côté du centre organisateur des microtubules (MTOC), marquage de l'ensemble de la matrice MT crée un inconvénient dans l'exécution de l'analyse d'image des extrémités MT qui ne sont pas à proximité de la cellule périphérie 75-77. Des expériences utilisant deux couleurs co-marquage de MTs avec la tubuline fluorescente et EB3 fluorescente dans les cellules vivantes ont révélé, qualitativement, que la grande majorité des MTs de tubuline marqués sont également EB3 marqué 78. En outre, il n'a pas été une méthode efficace de suivi automatisé des MTs étiquetés avec la tubuline fluorescente. Cela signifie que les données collection et de mesures de la dynamique MT dans les cellules exprimant la tubuline fluorescente nécessitent un suivi de main de MTs individuels, un processus qui est sujette aux erreurs et fastidieux. Par conséquent, l' analyse automatisée de calcul EB3 marqué MTs est devenue la méthode préférée pour la mesure de la dynamique des MT , car il peut être appliqué à TA dynamique des expériences sur de nombreux types cellulaires et dans une variété de régimes expérimentaux 35,79.
Lier MT Growth Dynamics à HUVEC Morphologie et migration.
Du point de vue d'un enquêteur du cytosquelette, une adaptation extrêmement utile de l'plusTipTracker analyse automatisée de suivi est la capacité de mesurer et d'évaluer les deux cellules et régionales des changements entiers dans la dynamique de croissance MT. L'exigence d'une cellule à devenir polarisée est une condition préalable essentielle pour la migration cellulaire directionnelle. En tant que tel, les indices de signalisation polarisées sont connus depuis longtemps comme des facteurs clés de conduite pour la migration cellulaire directionnelle 30,31,51,54,56,80,81 </sup>. Par exemple, des molécules de signalisation solubles tels que le VEGF induisent la polymérisation de l' actine et de la croissance MT vers la queue de VEGF dans des types de cellules endothéliales 2,82-87. En outre, en réponse à des interactions physiques avec l'ECM (par exemple, la conformité et la dimensionnalité mechanosensing), HUVEC moduler leur dynamique de MT en régulant localement MAPs pour promouvoir la croissance de MT dans les allongeant saillies ramifiées, et cela sert à guider la migration HUVEC dans le sens de la cue 5,31,88. Ainsi, la polarisation en réponse à extracellulaires signalisation des indices met en évidence la nécessité d'une évaluation expérimentale des changements localisés dans la dynamique du cytosquelette.
Simultanée imagerie des cellules vivantes de la dynamique MT de croissance (en utilisant l'approche de EB3) et la migration des cellules HUVEC est extrêmement difficile à réaliser parce que MTs poussent sur une échelle de temps de secondes, tandis que les changements dans la morphologie cellulaire et la migration directionnelle se produisent sur une échelle de temps des heures. Pourtant, les deux processus sont intimement linkeré. De plus, en continu, l'imagerie rapide de EB3 d'marqué par fluorescence sur la seconde échelle de temps conduit à photoblanchiment du signal de EB3. Les tentatives de surmonter ce problème en effectuant de courtes séries d'imagerie de EB3 (série d'acquisition 1-2 min) toutes les 30 minutes ont été couronnés de succès, mais ne pouvait être accompli dans un petit nombre de ECs qui avait une expression optimale de EB3 et qui n'a pas afficher défavorable effets à répétition illumination laser 5.
Une approche alternative qui permet des interprétations de la façon dont la dynamique de croissance MT contribuent aux changements dans la morphologie cellulaire et la migration est la région plusTipTracker d'intérêt (ROI) outil 35 (voir le protocole 6.6). Cette méthodologie permet une croissance entière de MT cellulaire pistes pour être sous-divisé en régions définies par l'utilisateur, à partir de laquelle les pistes de croissance MT peuvent ensuite être extraites et analysées. Par exemple, des comparaisons de «ramifié» par rapport à des régions «non-ramifiés" de la cellule ont révélé que MTs croître plus spetits et plus persistant au sein des régions ramifiées par rapport à la périphérie des cellules 5 non ramifié. Dans la plaie de pointe polarisée HUVEC, les comparaisons des principaux bord de fuite et la dynamique de croissance bord de MT a révélé que induit MCAK-MT désassemblage est inhibée spécifiquement dans le bord d'attaque, mais pas le bord de fuite. évaluation régionale de début et de fin dynamique de croissance bord de MT dans HUVEC exprimant Rac1 et / ou mutants de phosphorylation de MCAK a en outre révélé que l'activation Rac1-induite de kinase Aurora-A spécifiquement et localement inhibe l'activité de MCAK dans le bord d'attaque pour conduire HUVEC polarisation et migration directionnelle 31. Ainsi, la combinaison de suivi automatisé de la dynamique de croissance MT et de l'évaluation régionale du MT dynamique de croissance dans les saillies ramifiés et / ou le bord d'attaque de la plaie bord HUVEC nous a permis de relier la dynamique de croissance MT à HUVEC morphologie et de la migration.
Les protocoles décrits sont designed de fournir une méthodologie généralement simple et hautement reproductible pour la culture HUVEC et investigation expérimentale. Néanmoins, la plupart des détails du protocole sont complexes et prennent du temps, ce qui, à son tour, offre la possibilité d'erreurs ou de difficultés dans la conduite de la méthode expérimentale. Bien qu'il ait été tenté de résoudre les problèmes potentiels à travers le protocole, est ici fourni, le dépannage détaillé des problèmes potentiels qui sont moins courants ou autrement abrégé en notes dans les protocoles méthodologiques.
Associées à des lamelles de revêtement avec des substrats de polyacrylamide (protocole de 2,2), un problème commun qui se pose est la complexité de l'activation des lamelles de verre, le couplage de polyacrylamide au verre, en activant le polyacrylamide, puis le couplage ECM à l'polyacrylamide. Une étape particulièrement difficile et potentiellement problématique est la culture de HUVEC sur le gel de fibronectine / polyacrylamide après une exposition de l'polyades lamelles couvre-crylamide revêtu à 2 mM sulfo- SANPAH (étape 2.2.2.6, ci-dessus). Il est critique pour le succès de la mise en culture des cellules HUVEC sur ces substrats sulfo- SANPAH être complètement retiré du système expérimental suivant ECM conjugaison. Ceci peut être mieux accomplie par lavage à l' ddH 2 O et en incubant les lamelles en ddH 2 O sur un agitateur pendant une nuit. Si les cellules cultivées sur les ECM de polyacrylamide ne survivent pas, ou si la viabilité est moins que prévu, a augmenté et a répété le lavage des sulfo-SANPAH après conjugaison à la fibronectine (étape 2.2.2.9) est recommandée pour atténuer potentiellement ce problème.
Associés au protocole 3 (ADNc transfection et culture HUVEC sur une lamelle), une influence majeure au succès de la procédure d'électroporation est la manipulation des HUVEC à la fois pendant la trypsine des cellules pour les retirer de la fiole en plastique, et après la conclusion de l'électroporation (étapes 3.3 à 3.4 ci-dessus). Il est essentiel de prendre soincontrôler complètement le HUVEC tandis que la trypsine, et ne pas dépasser le temps nécessaire pour que les cellules «round-up" à la surface du ballon (généralement 1-2 minutes). temps excessif dans la trypsine est une cause majeure de HUVEC la mort, qui est généralement pas réalisé jusqu'à ce que les cellules sont étalées sur des lamelles revêtues de fibronectine (étape 3.4) et ne parviennent pas à fixer sur le substrat.
D'une importance similaire, HUVEC (et la plupart des types de cellules primaires) ne se portent pas bien lorsqu'ils sont suspendus pendant de longues heures dans le tampon d'électroporation. Au cours d'expériences à grande échelle, par exemple, où l'utilisateur dispose de cinq ou plusieurs conditions qui nécessitent une électroporation, il est préférable de garder les cellules sédimentées dans des tubes individuels (1 tube par transfection) et de les mélanger, un à-un-temps , dans le tampon d'électroporation immédiatement avant électroporation. Cette approche réduit le temps d'incubation dans le tampon d'électroporation et de survie HUVEC maximisée. En outre, le sauvetage immédiat dans les milieux de culture complet est aussi critical électroporation suivant. retards de sauvetage d'une minute ou plus électroporation suivantes peuvent entraîner près de la mort complète HUVEC et doivent donc être évités.
Liés détermination de migration cellulaire (Protocole 9), la technique de culture de cellules HUVEC à une densité extrêmement élevée dépend d'une modification critique (décrit à l'étape 9.2) de la méthode de culture de cellules HUVEC classique (décrite dans le protocole n ° 3) qui nécessite un séchage de la fibronectine enduit lamelle afin de permettre à la culture de HUVEC dans une très petite zone de la lamelle couvre-objet. Souvent, si la lamelle couvre-objet ne soit pas complètement séché, ou si le revêtement préalable de la lamelle couvre-objet avec de la fibronectine (étapes 2.1 ou 2.2) n'a pas été efficace, les cellules contenant un milieu qui est placée sur la lamelle couvre-objet vont perdre sa tension de surface et augmenter la les bords de la lamelle, ce qui réduit la densité des cellules sur la lamelle. Une méthode pour résoudre ce problème potentiel est d'aspirer les médias de la lamelle, puisplacer la lamelle (encore dans son plat de 35 mm) à l'arrière de l'enceinte de sécurité biologique pendant 5-10 min. Cette adaptation peut contribuer à permettre l'écoulement d'air à l'intérieur du coffret pour faciliter le séchage de la vaisselle. Si un liquide visible reste sur la lamelle après séchage à l'air, aspirez les taches liquides et encore laisser sécher pendant 5-10 minutes supplémentaires dans l'armoire de biosécurité. Il est important de noter qu'il n'y a aucun moyen d'éviter complètement ce problème potentiel, mais il ne devient moins d'un problème avec la pratique répétée du protocole. Il est également une recommandation de dépannage lors de la préparation des lamelles pour le dosage de la migration des cellules (ou tout dosage, en général), pour préparer des lamelles supplémentaires et ont HUVEC supplémentaires prêt-à-aller en cas de problèmes le long du chemin.
Avec ces considérations de dépannage à l'esprit, il est également important de mettre en évidence l'utilité des protocoles discutés et leurs implications dans les futures recherches sur la biologie cellulaire. L'applicabilité à l'polyacrapproche ylamide est vaste et comprend non seulement des études en deux dimensions de l' engagement cellule-ECM (décrit ci – dessus), mais aussi des enquêtes en trois dimensions 5. Cette application est essentielle pour accroître notre compréhension de la façon dont HUVEC régulent la forme des cellules et de la migration dans des environnements physiologiques et devrait fournir aux chercheurs une compréhension de base de la façon dont les changements morphologiques sont coordonnés avec les changements du cytosquelette. Bien que les protocoles décrits ici se concentrent sur des mesures de la dynamique de croissance MT, la majorité des protocoles peut et doit être adapté pour mesurer un certain nombre d'autres aspects des interactions microscopiques mesurables cellule-ECM. En ce qui concerne la dynamique MT, il existe de nombreuses cartes, y compris au moins 14 familles de kinésines 89, chacun ayant un rôle potentiel dans la contribution à HUVEC polarité et migration dirigée, et qui peuvent tous être étudiés en utilisant les protocoles présentés.
Les recherches futures devraient uneLSO être ciblées sur l'engagement des cellules ECM dans des conditions normales par rapport à des états pathologiques. protocoles HUVEC présentés ici sont applicables aux enquêtes sur les processus homéostatique vasculaires normales, ainsi que des états pathologiques, y compris les maladies cardiaques, la rétinopathie, la croissance tumorale et les métastases, pour ne citer que quelques-uns. Conjuguer ECM et polyacrylamide substrats visiblement transparents de conformité se prêtent à des études microscopiques permettra des études d'engagement cellulaire ECM tels que l'angiogenèse des cellules endothéliales vasculaires peut être contrôlé avec une résolution spatiale et temporelle. Ces types d'approches expérimentales ont déjà commencé à révéler d' importantes différences dans la forme des cellules endothéliales, la polarité, la migration, et les effets des protéines qui régulent ces processus 5,31,90. Les efforts futurs devraient viser à déterminer comment la combinaison de la conformité ECM et dimensionnalité mechanosensing peut servir à localement des protéines de contrôle qui ciblent et régulent la dynamique du cytosquelette.
The authors have nothing to disclose.
Un merci spécial à Dr. Clare M. Waterman pour le mentorat et les discussions, Michelle Baird et Mike Davidson pour fournir un grand nombre de constructions d'ADNc fluorescents utilisés dans ces études, et Kathryn Applegate et Gaudenz Danuser pour le développement de logiciels d'analyse plusTipTracker MT. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention à KAM du National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) et le National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).
Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
Fetal bovine serum 25 mL | |||
Bovine brain extract 2.0 mL | |||
Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
Hydrocortisone 0.5 mL | |||
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
plusTipTracker | |||
Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin | Corning | MT25053CI | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |