عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي
Özet
Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
Abstract
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
Introduction
يتم تشغيل الأوعية الدموية عن طريق الاشارات إشارات الخلية التي تعزز الخلايا البطانية (ECS) إلى استقطاب، تهاجر مع خصوصية الاتجاه، وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة في الأنسجة التي تحتاج إلى إمدادات الدم. العوامل المساهمة يعتقد أن تدفع الأوعية الدموية هي إشارات من المصفوفة خارج الخلية (ECM). في استجابة لمنبهات المادية، ECS تمديد فروع جديدة مع خصوصية الاتجاه لتوجيه حركة الاتجاه في تشكيل 1،2 شبكة الأوعية الدموية. يتم تعريف بنية مورفولوجية EC والمتفرعة من قبل تنظيم مترجم من الهيكل الخلوي أنيبيب (MT) في الطريقة التي يتم تنسيقها مع تنظيم ACTO-الميوسين انقباض 3. من أجل فروع المفوضية الأوروبية لتشكيل، الميوسين-II يجب downregulated محليا، مما أدى إلى نتوءات غشاء المترجمة 4. في نفس الوقت وفي نفس المكان داخل الخلية، تصبح ديناميات النمو MT تعديل مما أدى إلى بطء واستمرار النمو MT لتعزيز فرع ايلونgation والاستقرار 5. هذه اللائحة هيكل الخلية منسقة يسمح ECS لاستقطاب التشكل لتسهيل الهجرة الاتجاه.
تطوير مورفولوجيا الخلايا الاستقطاب تتطلب MT الاستقطاب التجمع 6. في هجرة الخلايا الظهارية، النظام التجاري المتعدد الأطراف تنمو ببطء وإصرار على وجه التحديد في طليعة من الخلية 7-9. بينما في الخلايا العصبية، وبدء واستطالة من المحاور أو التشعبات يتطلب أن النظام التجاري المتعدد الأطراف هي الحالية فحسب، بل أنهم يخضعون لعمليات التجميع والتفكيك 10-15 حيوي. وبهذه الطريقة، ومراقبة المترجمة من ديناميات النمو MT تحدد بنية الخلية، ويسمح لإعادة السريع للمورفولوجيا الخلايا كما ECS التنقل من خلال ECM بهم.
وينظم ديناميات النمو MT عائلات البروتينات المحركات الجزيئية والبروتينات غير الحركية، ووصف أنيبيب أسوشيتد البروتينات أو أنيبيب متبادلة البروتينات (refe من الآن فصاعداrred إلى شكل خرائط). يتلخص يمكن تفعيلها محليا أو المعطل، وعادة من خلال إشارات أجهزة الطرد المركزي التي بدأت في واجهة خلية ECM 16،17. وظيفة والخرائط مرة واحدة نشطة من قبل ملزما للطن متري، وتغيير حركية التجمع طن متري، والتفكيك. وبالتالي تعمل على تنظيم محليا ديناميات MT من أجل تعزيز شكل الخلية والاستقطاب 18-20. الإنقسامية السنترومير أسوشيتد كينيسين (MCAK) هو كينيسين-13 MAP الأسرة التي تربط لغايات طن متري، والأزواج المائي ATP إلى MT التفكيك 21-23. وتعرف هذه الدور الوظيفي للMCAK أن تكون حاسمة في الإنقسامية المغزل 24-28، وكذلك أثناء الطور البيني 29،30. ضمن البيني ECS، وينظم بوساطة MCAK التفكيك طن متري بحلول محلية أورورا-A الفسفرة الناجم من MCAK ردا على الجرح الحافة تفعيل الناجم من GTPase RAC1 صغير. نتائج هذا شلال يشير هو تثبيط MCAK في طليعة من ECS، مما أدى إلى نمو MT المستقطب نحو جنيهADING حافة والناجم عن MCAK MT التفكيك في الحافة الخلفية المهاجرة ECS 31.
وقد استخدمت المنهجيات التقليدية لقياس ديناميات النمو MT عادة تتبع يد إما تويولين fluorescently المسمى أو، في الآونة الأخيرة، fluorescently المسمى-MT نهاية ملزم البروتين 1 أو 3 (EB1 أو EB3، على التوالي). النهج تويولين الفلورسنت في الاستفادة من وصفها مجموعة MT بأكملها. ومع ذلك، لأن الغالبية العظمى من أنواع الخلايا الإنقسامية الحفاظ على مجموعة شعاعي من النظام التجاري المتعدد الأطراف أثناء الطور البيني 8،32،33، النظام التجاري المتعدد الأطراف بالقرب من الجسيم المركزي هي كثيفة جدا، ونتيجة لذلك، وتتبع نمو طن متري، والتفكيك مع تويولين الفلورسنت وعادة ما تقتصر على الطرفية مناطق الخلية. وبسبب هذه القيود، وقد تم استخدام البروتينات EB-fluorescently المسمى (EB1 أو EB3) النهج الأكثر شيوعا لقياس ديناميكية طن متري. لأن EBS تسمية فقط المتنامية زائد أقاصي النظام التجاري المتعدد الأطراف، فإنها تبدو وكأنها صغيرة (1-3 ميكرون)، فلوري الزاهية يأتيالخبر، وبالتالي توفير علامة ملحوظ بسهولة من MT البلمرة مع محدود جدا مضان الخلفية 34-37. في حين أن EBS التسمية فقط مجموعة فرعية من مجموعة MT تمثل القوة الرئيسية في منهجية EB، فإنه يسلط الضوء أيضا واحدة الحد المهم، لا يتم المسمى أن النظام التجاري المتعدد الأطراف غير متزايد من قبل نهج EB3. ومع ذلك، فإن القدرة على قياس وتتبع المذنبات EB3 مع مرور الوقت وتصور النمو MT داخل الأقاليم الفرعية الخلوية جعل هذا النهج المثالي للتطبيقات التي تتطلب تقييم الإقليمي لمنظمة طن متري.
وكان الحد الحرج آخر المنهجيات التقليدية لقياس ديناميات النمو MT مجموعات البيانات الكبيرة جدا والوقت اللازم لتحليل البيانات. وينبع هذا الحد من الحاجة إلى تتبع يد مئات من المذنبات EB في قرار الأوان. وعلاوة على ذلك، تحتاج هذه القياسات ينبغي القيام به في عدد كبير إحصائيا من الخلايا وأجريت في إطار مجموعة من الرقابة وexperime أيضاشروط ntal. في الآونة الأخيرة، وقد تم التغلب على هذه المعوقات من خلال تقنيات تحليل الحسابية موجهة تحديدا في المذنبات تتبع EB3 استخدام الوقت الفاصل بين المجهري في الخلايا الحية 35. عند استخدامها بشكل مناسب، وهذا النهج الحسابي يخدم على حد سواء تقييد إمكانية للخطأ البشري المرتبط ناحية تتبع بالإضافة إلى النص على طريقة والإنتاجية العالية لقياس MT البلمرة. التحليل الحسابي للديناميات MT باستخدام حزمة البرمجيات القائمة على ماتلاب، plusTipTracker، ويسمح لقياسات النمو MT عن طريق تتبع المذنبات EB3 fluorescently المسمى 5،31،35،38. بالإضافة إلى ذلك، البرنامج plusTipTracker يسمح للحسابات أحداث كارثة MT (ويعرف أيضا باسم التفكيك) استنادا إلى اختفاء المذنبات EB3 في تزايد المسار MT، ويسمح للتحليل دون الخلوي (الإقليمي ويعرف أيضا باسم) من ديناميات النمو MT داخل المناطق المعرفة من الفائدة . لدراستنا، وتمت مقارنة ديناميات النمو MT داخلمناطق متفرعة مقابل المناطق غير متفرعة، أو داخل الرائدة مقابل زائدة حواف الخلية. ويمكن أيضا إخراج البيانات من البرامج plusTipTracker أن تستخدم لتوليد مرمزة تراكب المسار الصحيح للخلايا فردية والمناطق الفرعية الخلوية.
نحن هنا وصف المنهجية المستخدمة للتحقيق في دور MCAK في تحوير ديناميات النمو طن متري، ومساهمة هذا depolymerase MT إلى تنظيم المفوضية الأوروبية المتفرعة التشكل والهجرة الاتجاه. تستخدم نهجنا خط أساسي البشري الخلايا، خلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs)، والتي هي تربيتها بسهولة وقابلة للغاية لالناجم عن Electroporation لل، ترنسفكأيشن عابرة من كدنا] البلازميد. ثم استخدمنا عالية الدقة، والوقت الفاصل بين مضان المجهري HUVECs transfected مع MT نهاية ملزم بروتين 3 (EB3) والميتوزى السنترومير أسوشيتد كينيسين (MCAK) [كدنا -specific يبني لتقييم الآثار المترتبة على ديناميات MT transfected HUVECs. استنادا PlusTipTracker تحليل صورة الحسابية من EB3كان MT -labeled بالإضافة إلى الغايات لقياس سرعة نمو طن متري، وعمر النمو MT في الوقت الفاصل بين الصور، لقياس ومقارنة آثار التلاعب التجريبية على ديناميات النمو طن متري. هذه المنهجية تسمح لدراسة ديناميات طن متري، وتحديد كيفية تنظيم محلي ديناميات MT داخل المناطق الفرعية الخلوية يساهم في عمليات عائية من المفوضية الأوروبية المتفرعة والهجرة. هذه التقنيات قابلة للتطبيق على التحقيق في أي خطة التي يمكن fluorescently المسمى، وأعرب في الخلايا الحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام HUVECs في علم الصرف والهجرة التجارب.
التصوير الخلية الحية من ديناميات النمو MT-وصفت EB3 داخل HUVECs يتطلب شروطا ثقافة الخلية المناسبة وقابلة للتكرار من أجل قياس وتقييم التغيرات في نمو طن متري، وHUVEC التشكل، بحيث يمكنهم بعد ذلك أن تسند إلى جديلة ECM الإشارة. HUVECs تمثل نموذجا ممتازا لدراسة شكل الخلية والحركة. وهي قابلة للغاية لترنسفكأيشن مع cDNAs fluorescently المسمى، فإنها تظهر الأشكال التضاريسية دراماتيكية ردا على كل من العظة إشارات قابلة للذوبان والجسدية، وأنها تحافظ على القدرة على تنظيم أنفسهم في أنابيب الأوعية الدموية عندما هيأ ظروفا ثقافة الخلية المناسبة 65-70. مزارع الخلايا الأولية، مثل HUVECs، تتطلب معالجة متأنية ورصد عدد الخلايا مرور من أجل ضمان الخلايا السليمة، وأنها سوف تتصرف عادة خلال التجريب. على سبيل المثال، عند إجراء التجارب التحقيق في cytoskeleطن و / أو مورفولوجيا الخلايا، HUVECs لا ينبغي أن تستخدم للتجارب ما بعد العاشر مرور ثقافة الخلية، كما HUVECs عادة تبدأ في عرض الأشكال التضاريسية غير موحدة حول مرور 12-15.
كثافة الخلية هي أيضا منظم ينتقد HUVEC الصحة والانتشار. HUVEC التحقيقات المتفرعة (انظر بروتوكول 10،1-10،4 أعلاه) تستخدم منخفضة نسبيا الثقافات كثافة الخلايا من أجل توفير الخلايا المساحة الفعلية للتفاعل مع ECM وتمديد نتوءات متفرعة. في المقابل، في دراسات الهجرة الجرح الحافة (انظر بروتوكول 10،5-10،8)، HUVECs هي الثقافة في أحادي الطبقة قبل إصابة. كما عرض من هذا القبيل، HUVECs الجرح الحافة التشكل نسبيا برنامج الأمم المتحدة للأفرع، تمديد الرائدة نتوءات الحافة، وتظهر التفاعلات خلية خلية مع جيرانها المباشرين حيث يهاجرون إلى الجرح.
المحاذير ومزايا تتبع MT حيوية في المعيشة HUVECs.
الغزل المجهر القرص هو طريقة ممتازة لاختبار الفرضيات التجريبية التي تتطلب وضوح الصورة متحد البؤر مع ارتفاع الوقت القرار. مع الكاميرا والليزر وحدة مناسبة، فإن هذا النهج المجهر حساس لمضان الانبعاثات المنخفضة ويمكن أن تساعد في خفض photobleaching من مقارنة مع أنواع أخرى من مضان المجهري. الأهم من ذلك، هذا النهج هو أيضا مناسبة تماما لمتوسطة إلى عالية وقت التصوير القرار كما هو مطلوب لتوليد قياسات شاملة من ديناميات النمو MT باستخدام نهج وضع العلامات EB3، في مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا.
في حين أن منهجية EB3 من العلامات تنمو MT بالإضافة إلى الغايات لديها مزايا واضحة على وسائل أخرى للوضع العلامات fluorescently النظام التجاري المتعدد الأطراف، كما أن لديها عيوب فريدة من نوعها. على سبيل المثال، هناك نسبة من مجموعة MT الذي لا ينمو بنشاط في أي وقت من الأوقات، بما في ذلك السكان من النظام التجاري المتعدد الأطراف تفكيك وسكان مستقر، النظام التجاري المتعدد الأطراف غير ديناميكية 71-74. سوف EB3 لا تسمية هذين الشعبين من النظام التجاري المتعدد الأطراف ووبالتالي فإن مساهمة هذين الشعبين لن تدرج في تحليل البيانات التجريبية. وقد ركزت منهجيات بديلة لتقييم مجموعة MT بأكملها على التعبير عن تويولين-fluorescently المسمى، الذي يدمج جميع السكان من النظام التجاري المتعدد الأطراف، ويسمح لتحديد المتنامية، وتقلص ومستقر النظام التجاري المتعدد الأطراف. ومع ذلك، ونظرا للكثافة عالية نسبيا من مجموعة MT بالقرب من مركز الخلية والمتاخمة للأنيبيب تنظيم المركز (MTOC)، واصفة مجموعة MT كامل يخلق وضع غير مؤات في تحليل الصور الغايات MT التي ليست بالقرب من خلية محيط 75-77. وقد كشفت التجارب باستخدام اللونين شارك في وضع العلامات على النظام التجاري المتعدد الأطراف مع تويولين الفلورسنت وEB3 فلوري في الخلايا الحية، نوعيا، أن الغالبية العظمى من النظام التجاري المتعدد الأطراف المسمى تويولين هي أيضا 78 وصفت EB3. بالإضافة إلى ذلك، لم يكن هناك وسيلة فعالة لتتبع الآلي من النظام التجاري المتعدد الأطراف المسمى مع تويولين الفلورسنت. وهذا يعني أن جامعي البياناتنشوئها وقياسات ديناميات MT في الخلايا معربا عن تويولين الفلورسنت تتطلب تتبع يد النظام التجاري المتعدد الأطراف الفردية، وهي عملية عرضة للخطأ ومملة. ونتيجة لذلك، أصبح التحليل الحسابي الآلي من EB3 المسمى النظام التجاري المتعدد الأطراف منهجية المفضلة لقياس ديناميكية MT كما يمكن تطبيقها على MT ديناميات التجارب عبر العديد من أنواع الخلايا وضمن مجموعة متنوعة من الأنظمة التجريبية 35،79.
ربط MT النمو حيوية لHUVEC الصرف والهجرة.
من وجهة نظر محقق هيكل الخلية، واحد التكيف مفيد للغاية من plusTipTracker الآلي تحليل تتبع هو القدرة على قياس وتقييم كل خلية والإقليمية تغييرات كاملة في ديناميات النمو طن متري. اشتراط وجود خلية لتصبح الاستقطاب هو شرط مسبق ضروري لهجرة الخلايا الاتجاه. كما معروف منذ فترة طويلة مثل هذه، العظة مما يشير الاستقطاب إلى العوامل الدافعة الرئيسية لاتجاهي خلية الهجرة 30،31،51،54،56،80،81 </سوب>. على سبيل المثال، يشير جزيئات قابلة للذوبان مثل عامل نمو بطانة الاوعية لحث بلمرة الأكتين والنمو MT نحو جديلة VEGF في أنواع الخلايا البطانية 2،82-87. بالإضافة إلى ذلك، ردا على التفاعلات المادية مع إدارة المحتوى في المؤسسة (على سبيل المثال، والامتثال وmechanosensing الأبعاد)، HUVECs تعدل ديناميات MT عن طريق تنظيم محليا الخرائط لتعزيز النمو MT داخل التمطيط نتوءات متفرعة، وهذا يعمل على توجيه الهجرة HUVEC في اتجاه جديلة 5،31،88. وهكذا، والاستقطاب في استجابة لمنبهات إشارات الخلية يسلط الضوء على الحاجة إلى تقييم تجريبي التغيرات المحلية في ديناميات هيكل الخلية.
في وقت واحد التصوير الخلية الحية من ديناميات MT النمو (باستخدام نهج EB3) وهجرة الخلايا HUVEC من الصعب للغاية على أداء لالنظام التجاري المتعدد الأطراف تنمو على نطاق ومرة ثانية، في حين تحدث تغييرات في شكل الخلية والهجرة الاتجاه على نطاق والوقت من ساعة. إلا أن كلا من العمليات لينكه وثيقد. وعلاوة على ذلك، المستمر، والتصوير السريع لEB3-fluorescently المسمى على نطاق والمرة الثانية يؤدي إلى photobleaching من الإشارة EB3. محاولات للتغلب على هذه المشكلة عن طريق إجراء سلسلة التصوير قصيرة من EB3 (1-2 دقيقة سلسلة الاستحواذ) وكانت كل 30 دقيقة ناجحة، ولكن يمكن أن يتحقق إلا في عدد قليل من ECS التي كان التعبير الأمثل للEB3 والتي لم تظهر سلبي آثار لتكرار إضاءة ليزر 5.
نهج بديل يسمح للتفسيرات كيفية مساهمة ديناميات النمو MT إلى تغييرات في شكل الخلية والهجرة هي منطقة plusTipTracker الاهتمام (ROI) أداة 35 (انظر بروتوكول 6.6). هذه المنهجية تسمح كله نمو الخلايا MT المسارات لتكون مقسمة إلى مناطق المعرفة من قبل المستخدم، والتي من مسارات النمو MT ومن ثم يمكن استخراج وتحليلها. على سبيل المثال، قد كشفت مقارنات "تشعبت" مقابل مناطق "غير متفرعة" الخلية التي النظام التجاري المتعدد الأطراف زراعة المزيد من الصورةالمتواضع وأكثر من ذلك باستمرار داخل المناطق تشعبت بالمقارنة مع خلية محيط غير متفرعة 5. في الاستقطاب الجرح الحافة HUVECs، كشفت مقارنات بين الحافة الأمامية وراء ديناميات النمو حافة MT التي يسببها MCAK MT التفكيك هو تحول دون تحديدا داخل الحافة الأمامية، ولكن ليس على حافة زائدة. وكشف تقييم الإقليمي الرئيسي وراء ديناميات النمو حافة MT في HUVECs معربا عن RAC1 و / أو المسوخ الفسفرة من MCAK كذلك أن تفعيل يسببها RAC1 لأورورا-A كيناز على وجه التحديد ومحليا يمنع النشاط MCAK داخل الحافة الأمامية لقيادة HUVEC الاستقطاب والهجرة اتجاهي 31. وهكذا، سمح مزيج من تتبع الآلي من ديناميات النمو MT والتقييم الإقليمي للديناميات النمو MT داخل نتوءات متفرعة و / أو الحافة الأمامية من الجرح الحافة HUVECs لنا لربط ديناميات النمو MT إلى HUVEC التشكل والهجرة.
والبروتوكولات المذكورة هي المصممد لتوفير منهجية واضحة عموما وقابلة للتكرار للغاية للثقافة HUVEC والتحقيق التجريبي. ومع ذلك، فإن العديد من تفاصيل بروتوكول معقدة وتستغرق وقتا طويلا، والتي، بدورها، توفر فرصة للأخطاء أو صعوبات في إجراء المنهجية التجريبية. في حين جرت محاولة لمعالجة المشاكل المحتملة في جميع أنحاء بروتوكول، وهنا يتم توفير إضافي، استكشاف الأخطاء وإصلاحها مفصل من المشاكل المحتملة التي هي أقل شيوعا أو يختصر على خلاف ذلك كما يلاحظ في بروتوكولات المنهجية.
تتعلق coverslips طلاء مع ركائز بولي أكريلاميد (بروتوكول 2.2)، وهي مشكلة شائعة الذي يطرح نفسه هو الطبيعة المعقدة لتفعيل coverslips الزجاج، اقتران بولي أكريلاميد على الزجاج، وتفعيل بولي أكريلاميد، ثم اقتران ECM للبولي أكريلاميد. خطوة صعبة للغاية، وربما الإشكالية والتثقيف HUVECs على فبرونيكتين / هلام بولي أكريلاميد بعد التعرض للبولياcoverslips المغلفة crylamide إلى 2 ملم سلفو SANPAH (الخطوة 2.2.2.6 أعلاه). فمن الأهمية بمكان لنجاح زراعة HUVECs على هذه الركائز التي سلفو SANPAH إزالتها تماما من النظام التجريبي التالية اقتران ECM. وهذا يمكن أن يكون أفضل إنجاز طريق الغسيل مع ده 2 O واحتضان لل coverslips في ده 2 O على شاكر بين عشية وضحاها. إذا الخلايا المستزرعة على موبينيل بولي أكريلاميد لا البقاء على قيد الحياة، أو إذا الجدوى أقل مما كان متوقعا، وزيادة وتكرار غسل سلفو SANPAH بعد الاقتران إلى فبرونيكتين (الخطوة 2.2.2.9) من المستحسن أن يحتمل تخفيف من حدة هذه المشكلة.
المتصلة بالبروتوكول 3 ([كدنا ترنسفكأيشن والثقافة HUVEC على ساترة)، له تأثير كبير على نجاح العملية Electroporation للهو التعامل مع HUVECs سواء أثناء trypsinization من الخلايا لإخراجها من القارورة البلاستيكية، وعقب اختتام وElectroporation لل(الخطوات 3،3-3،4 أعلاه). فمن الأهمية بمكان لرعايةرصد الكامل لHUVECs بينما في التربسين، وبحيث لا يتجاوز الوقت اللازم للخلايا أن "جولة المتابعة" على سطح القارورة (عادة 1-2 دقيقة). الوقت الزائد في التربسين هو سبب رئيسي للوفاة HUVEC، والتي عادة ما لم تتحقق حتى يتم مطلي الخلايا على coverslips المغلفة فبرونيكتين (الخطوة 3.4) ثم تفشل لنعلق على الركيزة.
نفس الدرجة من الأهمية، HUVECs (ومعظم أنواع الخلايا الأولية) لا تبلي بلاء حسنا عندما علقت لفترات طويلة في المخزن المؤقت Electroporation لل. خلال التجارب على نطاق أوسع، على سبيل المثال، حيث أن المستخدم لديه خمسة أو أكثر من الشروط التي تتطلب Electroporation لل، فمن الأفضل للحفاظ على الخلايا مكعبات في أنابيب الفردية (1 أنبوب في ترنسفكأيشن) ومزجها، واحد في واحد في وقت ، في المنطقة العازلة Electroporation للمباشرة قبل Electroporation لل. هذا النهج يقلل فترة حضانة في المخزن Electroporation للومكبر بقاء HUVEC. بالإضافة إلى ذلك، والإنقاذ الفوري في وسائل الإعلام ثقافة الكامل هو أيضا هيدروitical Electroporation للالتالية. تأخر الإنقاذ من دقيقة واحدة أو أكثر Electroporation للالتالية يمكن أن يؤدي إلى الموت القريب HUVEC كاملة وبالتالي ينبغي تجنبها.
المتعلقة فحص الهجرة الخلية (بروتوكول 9)، وتقنية زراعة HUVECs في كثافة عالية للغاية تعتمد على تعديل الحرج (كما هو موضح في الخطوة 9.2) من منهجية زراعة الخلايا HUVEC التقليدية (كما هو موضح في البروتوكول 3) يتطلب تجفيف فبرونيكتين المغلفة ساترة من أجل تمكين ثقافة HUVEC في منطقة صغيرة جدا من ساترة. في كثير من الأحيان، إذا كانت ساترة ليست جفت تماما أو إذا كان طلاء مسبق من ساترة مع فبرونيكتين (الخطوات 2.1 أو 2.2) لم يكن فعالا، والخلايا التي تحتوي على وسائل الإعلام التي يتم وضعها على ساترة سوف تفقد التوتر السطحي، وتوسيع ل حواف ساترة، مما يقلل من كثافة الخلايا على ساترة. أسلوب واحد لاستكشاف هذه المشكلة المحتملة هو نضح وسائل الإعلام من ساترة ثموضع ساترة (لا يزال في طبق 35MM به) في الجزء الخلفي من مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 5-10 دقائق. هذا التكيف يمكن أن تساعد على السماح لتدفق الهواء داخل مجلس الوزراء للمساعدة في تجفيف الطبق. إذا يبقى أي سائل مرئية على ساترة بعد تجفيف الهواء، ونضح البقع السائلة ومرة أخرى تسمح للهواء الجاف لمدة 5-10 دقيقة إضافية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. ومن المهم أن نلاحظ أنه لا يوجد طريقة لتجنب تماما هذه المشكلة المحتملة، ولكن لم أصبح أقل من قضية مع الممارسة المتكررة للبروتوكول. وإنما هو أيضا توصية استكشاف الأخطاء وإصلاحها عند إعداد coverslips لفحص الهجرة الخلية (أو أي فحص، بشكل عام)، لإعداد coverslips اضافية ويكون HUVECs إضافية جاهزة للذهاب في حالة حدوث مشاكل على طول الطريق.
مع هذه الاعتبارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها في الاعتبار، فمن المهم أيضا تسليط الضوء على فائدة من البروتوكولات مناقشتها وآثارها في مجال البحوث بيولوجيا الخلية في المستقبل. انطباق إلى polyacrنهج ylamide واسع النطاق، ويشمل ليس فقط دراسات ثنائية الأبعاد الاشتباك خلية ECM (المذكورة أعلاه)، ولكن أيضا تحقيقات ثلاثية الأبعاد 5. هذا التطبيق أمر بالغ الأهمية لزيادة فهمنا لكيفية تنظيم HUVECs شكل الخلية والهجرة في بيئات الفسيولوجية وينبغي أن توفر المحققين فهم أساسي لكيفية التغيرات المورفولوجية يتم التنسيق مع تغيرات هيكل الخلية. بينما البروتوكولات وصفها هنا يركز على قياسات ديناميات النمو MT، فإن الغالبية من البروتوكولات يمكن وينبغي تكييفها لقياس أي عدد من جوانب قابلة للقياس المجهر غيرها من التفاعلات خلية ECM. وفيما يتعلق ديناميات MT، هناك العديد من الخرائط، بما في ذلك 14 أسرة على الأقل من kinesins 89، ولكل منها دور محتمل في المساهمة في HUVEC الاستقطاب والهجرة الموجهة، وكلها يمكن أن يتم التحقيق باستخدام البروتوكولات المعروضة.
التحقيقات المستقبلية ينبغي ليسوتو أن تستهدف المشاركة خلية ECM في وضعها الطبيعي مقابل الدول المريضة. بروتوكولات HUVEC المقدمة هنا تنطبق على التحقيقات في عمليات التماثل الساكن الأوعية الدموية العادية، فضلا عن الحالات المرضية بما فيها أمراض القلب، واعتلال الشبكية، نمو الورم والانبثاث، على سبيل المثال لا الحصر. التصريف شفافة واضح موبينيل وبولي أكريلاميد ركائز الامتثال قابلة مع الدراسات المجهرية سيسمح للدراسات الجذب للخلية ECM مثل تلك الخلية البطانية الأوعية الدموية الأوعية الدموية يمكن رصدها مع القرار المكانية والزمانية عالية. وقد بدأت هذه الأنواع من المناهج التجريبية بالفعل للكشف عن اختلافات هامة في شكل الخلايا البطانية، والاستقطاب، والهجرة، والآثار المترتبة على البروتينات التي تنظم هذه العمليات 5،31،90. ينبغي أن تهدف الجهود في المستقبل لتحديد كيفية الجمع بين الامتثال ECM وmechanosensing الأبعاد يمكن أن تستخدم لمحليا البروتينات السيطرة التي تستهدف وتنظيم ديناميات هيكل الخلية.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكر خاص للدكتور كلير محمد الملاح للالإرشاد والمناقشات، ميشيل بيرد ومايك ديفيدسون لتوفير العديد من يبني [كدنا الفلورية المستخدمة في هذه الدراسات، وكاثرين آبلجيت واللاعب Gaudenz Danuser لتطوير plusTipTracker MT برامج التحليل. وأيد هذا العمل، في جزء منه، من خلال منحة لكام من القومي للقلب والرئة الدم المعهد (NHLBI) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH). (المنحة: 4K22HL113069).
Materials
| Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
| 2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
| 3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
| 405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
| anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
| ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
| ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
| ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
| ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
| Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
| Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
| Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
| EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
| Fetal bovine serum 25 mL | |||
| Bovine brain extract 2.0 mL | |||
| Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
| Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
| Hydrocortisone 0.5 mL | |||
| Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
| Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
| HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
| HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
| Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
| Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
| Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
| Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
| Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
| Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
| Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
| Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
| Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
| Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
| Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
| Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
| Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
| plusTipTracker | |||
| Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
| Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
| Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
| Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
| Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Trypsin | Corning | MT25053CI | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |
Referanslar
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate?. EXS. 94, 3-15 (2005).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
- Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
- Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
- Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
- Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
- Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
- Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
- Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
- Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
- Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
- Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
- van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
- Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
- Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
- Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
- Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
- Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
- Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
- Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
- Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
- Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
- Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
- Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
- Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
- Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
- Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
- Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
- Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
- Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
- Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
- Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
- Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
- Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
- Stout, A., D’Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138 (2014).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13 (2001).
- Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
- Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
- Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
- Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
- Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
- Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
- Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
- Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
- Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
- Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
- Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
- Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
- Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
- Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
- Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
- Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
- Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
- Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
- Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Biyoinformatik. 30, 2060-2065 (2014).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266 (2013).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636 (2013).
- Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Biyoinformatik. 28, 2276-2277 (2012).
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
- Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
- Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
- Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601 (2012).
- Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
- Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
- Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
- Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
- Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
- Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
- Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
- Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
- Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. . Live cell imaging: A laboratory. , 119-138 (2010).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
- Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way?. J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
- Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
- Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569 (2013).
- Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
- Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
- Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
- Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833 (2013).
- Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).
