Özet

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Published: June 22, 2016
doi:

Özet

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Abstract

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea humana e são rapidamente recrutados para sítios inflamatórios. Priming é um evento crítico que aumenta a funcionalidade fagocitária dos neutrófilos. Apesar de extensos estudos têm revelado a existência e importância de priming de neutrófilos durante a infecção e lesões, os meios de visualizar este processo in vivo têm sido indisponíveis. O protocolo fornecido permite o monitoramento do processo dinâmico de neutrófilos priming em animais vivos através da combinação de três métodos: 1) sinal de repórter DsRed – usado como uma medida de priming 2) in vivo rotulagem de neutrófilos – alcançada por injecção de antigénio anti-linfócito de fluorescência conjugada 6G (Ly6G) de anticorpo monoclonal (mAb) e 3) de imagem confocal intravital. Vários passos críticos estão envolvidos neste protocolo: Rato inflamação induzida por oxazolona pele da orelha, sedação adequada de animais, injeções repetidas de Ly6G anti-mAb, e prevenção do desvio de foco durante o exame. Embora não tenham sido observadas algumas limitações, tais como o limite de tempo de imagem contínua (~ 8 horas) em um mouse e o vazamento de isotiocianato-dextrano fluoresceína a partir de vasos sanguíneos no estado inflamatório, este protocolo fornece uma estrutura fundamental para imagiologia intravital de comportamento e função de neutrófilos com iniciador, que pode ser facilmente expandido para análise de outras células do sistema imunológico em modelos de inflamação do rato.

Introduction

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes e de curta duração em circulação. Eles são rapidamente recrutadas para os locais de infecção ou lesão, onde servem fagócitos como profissionais através de liberação de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, juntamente com grânulos contendo peptídeos antimicrobianos e proteases 1. Durante o seu recrutamento, os neutrófilos são "preparada" por vários agentes, incluindo os produtos microbianos, quimioatractivos, e citocinas inflamatórias, resultando em funcionalidade de fagócitos marcadamente melhorada após a chegada ao sítio de inflamação 2. Os mecanismos de escorvamento de neutrófilos têm sido extensivamente estudada in vitro 3,4; No entanto, o controlo dinâmico do processo in vivo, não foi possível até à data.

Recentemente, tornou-se imagens intravital uma técnica importante para visualizar e quantificar a dinâmica de processos biológicos celulares em organismos vivos. IntraviTal imagem pode ser realizada por meio de microscopia de excitação de um fotão convencional (por exemplo, confocal) ou microscopia multifotônica aproxima 5. Com o tempo, melhorias substanciais foram alcançados nesta técnica que permite maior resolução de imagem, profundidade de imagem melhorada, diminuiu photodamage tecidos e melhorada 6,7 estabilização de imagem. Dada a sua capacidade única para permitir a visualização dinâmica da migração celular e interação ao longo do tempo, microscopia intravital tem sido amplamente aplicada a diversas áreas de estudo em imunologia 8. imagens intravital permite imunologistas para melhor compreender e contextualizar as respostas imunes, tanto a nível celular e molecular em modelos animais vivos.

Os recentes avanços na transgênicos, bem como knock-in ratos repórter forneceram ferramentas úteis para o monitoramento dos comportamentos dinâmicos de neutrófilos em animais vivos. Lisozima M promotor-driven proteína verde fluorescente melhorada knock-inratos têm sido amplamente utilizados para caracterizar a motilidade de neutrófilos, monócitos e macrófagos, durante vários processos inflamatórios incluindo extravasamento, infecção bacteriana, e a inflamação estéril 9-15. Além disso, os ratinhos transgénicos que expressam uma energia de ressonância de fluorescência de transferência biossensor citoplasmática foram empregues para estudar as actividades dos neutrófilos mitogénio quinase extracelular regulada e proteína quinase A dentro de intestino inflamado 16. Um modelo murino com elevada especificidade para a expressão de fluorescência em neutrófilos é a knock-in rato Catchup, que produz a recombinase Cre, bem como a proteína fluorescente tdTomato, que por sua vez está acoplado a expressão de antigénio de linfócitos 6G (Ly6G) 17. A visualização de neutrófilos Ly6G deficientes via este modelo tem demonstrado que estas células exercer funcionalidade normal numa variedade de contextos in vivo inflamatórias estéreis ou infecciosas em. camundongos transgênicos expressando o DsRed fluorescente protein gene sob o controlo do rato interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) ter sido utilizada para visualizar os comportamentos motilidade de células produtoras de IL-1 – Acredita-se que os neutrófilos, os monócitos inflamatórios, e macrófagos activados – emergente em pele inflamada 18.

In vivo rotulagem pode servir como uma abordagem alternativa para a detecção de comportamentos celulares e moleculares de neutrófilos nos tecidos inflamados. Depois de injecção intravenosa de doses baixas de anticorpo monoclonal marcado por fluorescência anti-Gr-1 (Acm), a cascata de recrutamento de Gr-1 + neutrófilos foi visualizada em lesões da pele do rato infectados com Staphylococcus aureus 19. Administração in vivo de conjugados contendo estreptavidina conjugados 705 pontos quânticos nm e mAb anti-Ly6G biotinilado rotular especificamente neutrófilos circulantes 20. Além disso, a endocitose de tais conjugados em neutrophIL vesículas permite o acompanhamento do transporte de vesículas de alta velocidade em neutrófilos que migram para o interstício. In vivo, marcação com anticorpos de fluorescência conjugada contra a P-selectina Ligando-1 Glicoproteico (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e quimioquina (motivo CXC) do receptor 2 (CXCR2) num modelo inflamatória induzida por TNFa tem elucidado os mecanismos de regulação em jogo durante a inflamação precoce 21. neutrófilos polarizados sobressair urópodos PSGL-1-enriquecida para interagir com CD62L presente em plaquetas activadas, resultando na redistribuição de CD11b e CXCR2, receptores que dirigem a migração de neutrófilos e iniciam a inflamação.

IL-1β é um dos genes de assinatura que é elevado em neutrófilos sensibilizados 22. Em ratinhos repórter pIL1-DsRed, DsRed sinais de fluorescência (isto é., A activação do promotor de IL-1β) correlacionam-se positivamente com a IL-1β expressão de ARNm e a produção de proteína IL-1β. <sup> 18 Para monitorar o processo de priming de neutrófilos, um método de microscopia intravital foi desenvolvido envolvendo a indução de inflamação da pele com oxazolona (OX) no modelo do rato pIL1-DsRed seguinte rotulagem in vivo de neutrófilos com Ly6G anti-mAb fluorescência conjugada. Através deste modelo, é possível estudar o comportamento e função de neutrófilos, preparadas em modelos animais de várias doenças e desordens.

Protocol

Todos os experimentos com animais são realizadas de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Toledo. 1. A fenotipagem de pIL1-DsRed Mice NOTA: Offspring são gerados por meio de cruzamento ratos pIL1-DsRed heterozigotos com o tipo selvagem camundongos (WT) C57BL6. Três a quatro semanas filhotes velhos são considerados prontos para fenotipagem. Sangramento submandib…

Representative Results

Rastreio dos ratinhos pIL1-DsRed é realizada com base no sinal de fluorescência fenotípica DsRed produzido pelos seus leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. Estimulação por LPS é capaz de induzir a produção de IL-1β em células mielóides, incluindo neutrófilos, monócitos, e células dendríticas 26-28. Assim, os leucócitos isolados foram incubados com LPS durante 4 h antes da análise de citometria de fluxo. Em seguida, é definida para propaga…

Discussion

O objetivo deste estudo é desenvolver uma tecnologia para monitorar o processo de priming de neutrófilos em animais vivos, que ainda não foi cumprida pelas técnicas atualmente disponíveis. Para atingir este objectivo, três metodologias estabelecidas são realizados: 1) a indução de inflamação da pele em ratinhos repórter DsRed-driven promotor de IL-1p como uma medida da escorva, 2) in vivo rotulagem dos neutrófilos com doses baixas de fluorescência-conjugado anti-Ly6G mAb, e 3) de imagem de microsc…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

Heparin sodium APP Pharmaceuticals NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer Lonza 10-548E
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F0926
Lipopolysaccharides Sigma-Aldrich L4391
Ketamine hydrochloride Hospira NDC 0409-2051-05
Xylazine LLOYD Laboratory NADA #139-236
Acepromazine Boehringer Ingelheim ANADA 200-361
Hair-removal cream Church & Dwight
Acetone Fisher Scientific A16P4
Oxazolone Sigma-Aldrich E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody BioLegend 127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle BD 329461
FITC-CM-Dextran, 150 Kda Sigma-Aldrich 74817
Butterfly infusion set (27 G needle) BD 387312
FACSCalibur cytometer BD
CellQuest Pro software BD
Confocal microscope Olympus FV1000
Metamorph Software Universal Imaging

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