在活斑马鱼胚胎成像的亚细胞结构

体内成像提供在最生理上下文细胞行为的直接可视化。斑马鱼的胚胎，其快速的外部发展和丰富的允许荧光标记的遗传工具阵列的透明度，都促使越来越多地使用在体内显微镜阐明关键发育事件的动态。在斑马鱼神经系统发育的成像研究，例如大大扩展了我们的神经祖细胞的行为和他们的后代，包括其后续迁移，分化和电路集成^1-8命运的知识。

舞台现在设置调查亚细胞动力学这些细胞行为背后。事实上，斑马鱼已经被利用作为用于体内细胞生物学的工具。它现在是可能的可视化线粒体^9-11，中心体^2,8,12-14，高尔基¹⁵中，微管⁴和肌动蛋白¹⁶细胞骨架，内涵体¹⁷和顶膜的组件复杂^1,18，在体内斑马鱼胚胎其他亚细胞结构中。到目前为止，大部分的所谓对这些细胞器的功能来自于培养细胞研究他们的行为。而体外研究已经取得了巨大的洞察细胞生物学，细胞培养并不完全代表的体内情况的复杂性和因此不一定反映功能和体内亚细胞器的动力学。斑马鱼的胚胎提供体内替代一个可行的检查亚动态。

作为脊椎动物，斑马鱼拥有的同源那些在哺乳动物中发现许多器官系统（ 例如，视网膜神经）。此外，斑马鱼的胚胎被越来越多地用于人类疾病^19,20建模</s向上>，包括与中心体功能（ 例如，小头畸形²¹和勒伯尔先天性黑蒙^22）和线粒体功能（ 例如，帕金森氏病^23，τ蛋白病^10,24和巴特综合征^25）， 在体内在细胞和亚细胞水平的成像在这些情况下，将允许更好地了解细胞生物学的这些病理状态的根本。

这里描述的方法的总的目标是提供一种全面的指导来调查在使用体内光学显微镜斑马鱼胚胎细胞器和其它亚细胞结构。 参与体内可视化和跟踪亚细胞结构，整个工作流程描述-遗传标记的方法，以产生瞬时表达和稳定的转基因鱼，最后采用宽视场和共聚焦显微镜成像。虽然这些PROC的edures用于由众多斑马鱼实验室，中所述的协议进行了优化和简化调查亚细胞结构的动态。此处所描述的工作的两个特定方面值得提及：首先，使用在多个配置的GAL4-UAS表达系统在特定细胞类型的基因标签的细胞器。第二，宽视场和共聚焦显微镜的体内直接比较对图像亚细胞结构。

目前的策略，以转基因标签的细胞器和其他亚细胞结构的斑马鱼要么利用皑皑的mRNA ^1,4,8或基于DNA的结构，其中子元件直接驱动融合蛋白^9,14,15。 体外转录加帽的RNA结果的表达快速和广泛的表达，这不是组织特异性但是。此外，表达水平降低随着时间的推移加帽的RNA稀释或退化。因此，使用RNA的基于构造来检查在发育后期阶段的细胞器动力学是有限的（通常为3天受精后）。

这些限制可通过使用DNA构建，其中表达的空间和时间控制由特定的启动子元件决定来克服。当基于DNA构建中，以转基因表达水平的GAL4-UAS系统显著改善的上下文被用于观察^26,27。在此二分表达系统，细胞类型特异性启动子元件驱动的转录激活的Gal4的表达，而报道基因被克隆的Gal4的结合上游激活序列（UAS）的下游。由UAS记者用适当的Gal4的驱动相结合，表达可以被限制到特定的细胞类型，绕过需要每一个特定的表达模式所需时间来克隆的报告基因的不同启动子的后面。此外，多个UAS报告基因的表达可以是由一个单一的Gal4的激活驱动。与GAL4-UAS系统，从而为亚细胞标记的一种多功能灵活的遗传方式。

宽视场和共聚焦显微镜是大多数实验室的工作母机。宽视场系统通常使用弧光灯作为光源，并使用被放置在光路的端部的敏感照相机检测所发射的光。此成像模态典型地限制为薄的样品作为失焦光掩盖较厚样品在焦信息。共焦显微镜之处在于它们是建立有利于从焦平面比那些源于失焦（ 即 “光学切片^”）28日发起信号，宽领域的系统有所不同。以实现光学切片的针孔被放置在发射路径中的共轭位置以所述点光源。激光器被用作光源和信号与光电倍增管（PMT）来检测。实际上，激光束在样品刷卡逐点和在各点（像素）的荧光发射由光电倍增管检测到。

在这里，我们的图像中同时使用宽视场和共聚焦显微镜以提供镜方式的直接比较活的斑马鱼胚胎非常相同的亚细胞结构。提供这种比较的基础的目的是提供选择适合手边的特定问题的最合适的显微技术的指导方针。

使用这里介绍我们证明线粒体和中心体的GAL4-UAS的遗传标记的方法。这些细胞器是使用宽视场和共聚焦显微镜来证明每个成像模态的适用性在不同细胞类型中的肌肉细胞的神经系统和成像。这里描述的方法可以容易地适于在活斑马鱼胚胎调查其他细胞器和亚细胞结构。