This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.
Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.
Jusqu'à récemment, la génération post-natal de nouveaux vaisseaux sanguins était censé se produire exclusivement par l'entremise d'un processus appelé angiogenèse, définie comme la germination de nouveaux vaisseaux à partir des cellules endothéliales des vaisseaux préexistants. 1 Ce processus contraste de la vasculogenèse, ou la formation de novo de vaisseaux sanguins à partir de progéniteurs endotheliales, qui a été supposée se produire exclusivement pendant l'embryogenèse. 2 Cependant, des études plus récentes ont identifié et isolé circulant cellules progénitrices endothéliales (EPCs) dans le sang périphérique des adultes. Ces cellules ont la capacité de se différencier en cellules endothéliales matures en culture et sont soupçonnés de participer à la vasculogenèse postnatale. 3,4
Les protocoles pour l'isolement et l'expansion de ces EPC impliquent généralement la culture de cellules périphériques mononucléaires de sang (les PBMNCs) dans des milieux contenant des facteurs de croissance endothéliaux, y compris vascular facteur de croissance endothelial (VEGF) et le facteur de croissance des fibroblastes-2. 8/5 cultures EPC produisent une variété de types de cellules très différents. Les cultures initiales (<7 jours) sont dominées par un type de cellule monocytaire, connu dans la littérature comme «précoces» EPC. Malgré leur nom, ces cellules expriment le CD14 marqueur de monocyte, sont négatives pour le CD34 de marqueur de cellules progénitrices et expriment des niveaux minimes de la classique marqueurs endothéliaux CD31 et récepteur de VEGF 2 (VEGFR2). 5 culture continue donne lieu à une population secondaire de cellules, connu comme EPC fin excroissance ou cellules endothéliales excroissance de sang (BOECs), qui apparaissent comme des colonies discrètes de cellules endothéliales-like. Contrairement aux premiers EPC monocytaires, BOECs, qui ont également été appelé formant des colonies des cellules endotheliales (les CPEF), des cellules endotheliales excroissance ou des cellules endothéliales de fin de excroissance, présentent la morphologie pavée qui est typique des monocouches de cellules endotheliales et sont hautement similaires en marqueur de surface5 et l'expression du gène 9 à mûrir les cellules endothéliales.
La génération de cellules endotheliales en forme à partir de sang périphérique offre plusieurs avantages, en particulier pour l'étude de la dysfonction des cellules endotheliales associées à des troubles vasculaires tels que l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) 10 ou maladie de von Willebrand. 11 Avant la disponibilité de BOECs, endothelial cellules ne pouvaient être obtenues à partir d'organes explantées au moment du décès ou de la transplantation d'organes, ou isolés à partir de la veine ombilicale à la naissance. Cette disponibilité réduite représentée une sérieuse limitation à comprendre la biologie des cellules endotheliales à partir de patients souffrant de troubles cardio-vasculaires, ainsi que les interactions entre les cellules endothéliales et soit des cellules de sang ou de cellules murales. En outre, isolement et de culture une population pure de cellules endothéliales à partir de ces sources est techniquement difficile et les cellules obtenus par ces méthodes présentent seulement une limited capacité proliférative. BOECs offrent donc un substitut précieux pour l'isolement et la culture de cellules endothéliales primaires provenant de patients.
En plus de leurs applications in vitro, BOECs sont également potentiellement utiles dans des thérapies de transplantation autologue de cellules. Ces applications comprennent à la fois la transplantation de cellules endotheliales, de promouvoir la néovascularisation (voir 12 et les références qui y sont citées), ainsi que la génération de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). 13 iPSCs BOEC dérivés peuvent être utilisés pour la modélisation de la maladie et offrent un immense potentiel que le départ matériel pour les thérapies cellulaires autologues. BOECs reprogrammer plus rapidement et avec une plus grande efficacité que les fibroblastes de la peau. En outre, BOECs permettent également pour la génération des CSPi qui sont exempts d'anomalies du caryotype, ce qui est une caractéristique essentielle de toute technologie qui sera adapté pour les applications de translation. La capacité de générer iPSCs partir d'un échantillon de sang du patient unLSO élimine la nécessité d'une biopsie de la peau et la génération de fibroblastes de la peau, facilitant ainsi la génération de cellules de patients atteints de troubles cicatrisation ou les très jeunes enfants.
Le protocole détaillé ci-dessous, approuvé par et menées en conformité avec les directives du Comité Service d'éthique national de recherches (Est de l'Angleterre), fournit une méthode simple et fiable pour la génération de BOECs avec plus de 90% d'efficacité à partir d'un volume relativement faible (60 ml) de sang périphérique. Ces cellules sont hautement prolifératifs et peuvent être soumises à des passages à plusieurs reprises, ce qui permet la production de centaines de millions de cellules à partir d'un seul échantillon de sang.
We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke’s Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.
For blood collection | |||
60 mL syringe with luer-lok tip | BD | 309653 | |
19G Surflo Winged Infusion Set | Terumo | SV-19BL | |
50 mL conical centrifuge tube | StarLab | E1450 | 2 per donor |
Sodium Citrate | Martindale Pharmaceuticals | 270541 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
For buffy coat isolation | |||
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sterile wrapped plastic transfer pipettes | Appleton Woods | KC231 | |
Turk’s Solution | Millipore | 1.093E+09 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
For cell culture, passaging and freezing cells | |||
Type 1 Collagen (derived from rat tail) | BD Biosciences | 35-4236 | |
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
0.02M Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | prepared in reagent grade water |
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum) |
Lonza | CC-3202 | Note: It is essential that the medium does not contain heparin. Do not use EGM-2. |
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined | Hyclone | SH30070 | |
10x Trypsin EDTA | Gibco | T4174 | Dilute to 1x in PBS prior to use |
Heat Inactivated FBS | Gibco | 10500-064 | |
DMEM | Gibco | 41965-039 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
For flow cytometric characterization | |||
FITC-conjugated mouse anti-human CD14 | BD Biosciences | 555397 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
FITC-conjugated mouse anti-human CD31 | BD Biosciences | 555445 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse anti-human CD34 | BD Biosciences | 555824 | Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20 |
FITC-conjugated mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 560976 | Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2 | R&D Systems | FAB357A | Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10 |
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555748 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555751 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | R&D Systems | IC002A Dilution: 1:10 |
Clone: 11711 |
EDTA, 0.5M solution | Sigma-Aldrich | E7889 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
For immunofluorescent microscopy | |||
Corning Costar 24-well tissue culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody | R&D Systems | MAB72271 | Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml |
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144) | R&D Systems | AF938 | Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300 |
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF) | Abcam | ab154193 | Clone EPSISR15, use at 1:250 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21202 | Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200 |
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11055 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Life Technologies | A-10042 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 1 μg/ml |