A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Deepa Raghu; Joseph A. Christodoulides; James B. Delehanty; Jeff M. Byers; Marc P. Raphael

doi:10.3791/53120

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyomühendislik

Метку без Методика пространственно-временных изображений из одной клетки секрета

Published: November 23, 2015

doi:

10.3791/53120

Deepa Raghu¹, Joseph A. Christodoulides¹, James B. Delehanty², Jeff M. Byers¹, Marc P. Raphael¹

¹Materials Science and Technology,Naval Research Laboratory, ²Center for Bio/Molecular Science and Engineering,Naval Research Laboratory

Özet

Inter-сотовой связи является критическим для управления различными физиологические активности внутри и за пределами клетки. Эта статья описывает протокол для измерения пространственно-временную природу отдельных выделений клеток. Для достижения этой цели, междисциплинарный подход используется, которая объединяет без наклеек наноплазмонике зондирования с изображений живых клеток.

Abstract

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.

In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.

A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Introduction

Интер-сотовой связи имеет решающее значение для регулирования многих физиологических деятельности внутри и вне клетки. Разнообразие белков и пузырьков может быть секретируется, которые впоследствии вызывают сложные клеточные процессы, такие как дифференциации, заживления ран, иммунного ответа, миграции и пролиферации. ^1-5 Неисправности межклеточных сигнальных путей были вовлечены в многочисленных расстройств, включая рак, атеросклероз и диабет, чтобы назвать несколько.

Оптимальное клеток секреции анализа должен быть способен в пространстве и времени отображения секретируемый белок, представляющий интерес, не нарушая соответствующие сигнальные пути. Таким образом, причинно-следственные связи между концентрацией профилей и ответа принимающих клеток может быть выведено. К сожалению, многие из наиболее часто используемых флуоресцентных основе методов не отвечают этим критериям. Флуоресцентные слитые белки могут быть использованы, чтобы пометить аналит Within клетку, но могут нарушить секреторный путь, или если секретируемый, приводит к диффузного свечения вне клетки, которые трудно оценить количественно. Флуоресцентные immunosandwich основе анализы наиболее часто используемые методы для обнаружения клеточных выделений, но как правило, требуют изоляции отдельных клеток. ^6-11 Кроме того, введение чувствительного антитела, как правило, останавливается или заканчивает эксперимент и размер этикетки антител, 150 кДа IgG, является препятствием для передачи сигнала.

Из-за этих блок-постов, предпочтительно, чтобы методика этикетки свободной быть использованы для белковых изображения выделений и среди существующих меток, свободных технологий поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и локализованы поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) датчики являются превосходными кандидатами. ^12-17 Это Датчики были широко используется для исследования связывания аналита белков, экзосомы и других биомаркеров. ^18-24 В случае LSPR, плазмонного nanostructures можно рисунком литографически на покровные стекла и возбуждается с помощью видимого света с помощью стандартных конфигураций микроскопии широко местах. Из-за их наноразмерных след, большинство стеклянной подложке доступна общих методов визуализации, таких как светлого поля и флуоресцентной микроскопии делает эти зонды хорошо подходит для интеграции с живых клеток микроскопии. ^25-28 Мы показали измерения в реальном времени антител из гибридом выделениями клеток с использованием функционализированного золотые плазмонных наноструктур с пространственными и временными решениями 225 мс и 10 мкм, соответственно. Базовая конфигурация чип показано на рисунке 1. ²⁸ Путь Выход свет микроскопа разделить между ПЗС-камеры, используемой для съемки и волоконно-оптической сочетании спектрометра для количественного определения дробного заполнения данного массива наноструктур (рис 2 ).

Protocол представлены в этой статье описывает экспериментальную конструкцию для реального времени измерения одиночных клеток выделениями одновременно мониторинга реакцию клеток с использованием стандартного ярко-микроскопии. Мультидисциплинарная подход включает изготовление наноструктур, функционализации наноструктур для высоким сродством связывания аналитов, оптимизацию поверхности для как минимизации неспецифического связывания и характеризующей константы кинетической скорости с использованием коммерческого поверхностного плазмонного резонанса (SPR) инструмента, интеграции клеточных линий на подложку, и анализа изображений и спектральных данных. Мы ожидаем, эту технику, чтобы быть технологией для пространственно-временных карт сотовых выделениями и их причинно-следственных связей с получением клеток.

Protocol

1. Изготовление наноструктур Выбрать диаметром 25 мм покровные стекла с толщиной около 170 мкм из (№ 1.5) в качестве субстратов для нанофабрикации. Погрузитесь покровные в пираньи решение (3: 1 соотношении серной кислоты и перекиси водорода) в течение не менее 6 ч. Вымойте пираньи, смоченную покровное с обильным количеством сверхчистых 18,2 МОм деионизированной дистиллированной воды (DDW). ВНИМАНИЕ: Пиранья кислоты бурно реагирует с органическими материалами и должны быть обработаны с особой тщательностью. Депозит 10 нм хрома тонкая пленка на покровные испарением электронным пучком, чтобы избежать последствий обязанности во время структурирования и визуализации наноструктур. Спин первый слой резиста бислой, состоящий из этиллактат метилметакрилата (MMA_EL6) сополимера при 2000 оборотов в минуту в течение 45 с, а затем выпекать при 150 ° С. Спин второй слой поли-метилметакрилата (950PMMA_A2) в 3000 оборотов в минуту в течение 45 с, то выпекать при 180 ° С. Стукп двухслойная противостоять с помощью электронно-лучевой литографии (EBL) на 25 кВ с площадью дозе 300 мкКл / см 2. Разработка в изопропиловом спирте (IPA) / метилизобутилкетон (МИБК): 2/1 и промыть в ИПС. Депозит Ti (5 нм) / Au (80 нм) пленки на подложке с использованием электронно-лучевой испаритель. После осаждения золота, поднимите сополимер бислой противостоять путем замачивания субстрата в ацетоне в течение 4 ч. Проверьте подложку с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM), чтобы подтвердить форму и размер наноструктуры, удалить остатки хрома от подложки с помощью влажного травления с использованием CR-7 травителя в течение 60 секунд при комнатной температуре, а затем промыть в DDW. Дизайн расстояние от центра до центра массива в 33 мкм, чтобы оставить место для клеток изображений между массивами. Шаблон наноструктуры в 20 х 20 шаблон для каждого массива с шагом 300 нм с использованием писателя электронной луча. Каждый чип содержит 300 массивов с типичной наноструктур измерении высоты 80 ± 2,5 нм и 70 нм ± 2,5 Diameтер. Проверка подмножество массивов с использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) для проверки размера и однородности. Приложить опорное кольцо, обычно кремний, к задней части покровного стекла с помощью УФ-отверждения эпоксидной смолы. 2. Чип очистки и применение самоорганизующихся монослоя Для очистки и регенерации фишки, плазменный золы при мощности 40 Вт в 300 мТорр смеси 5% водорода, 95% аргона в течение 45 с после очистки камеры в течение 5 мин при тех же условиях. Функционализации золотых наноструктур сразу после плазменной озоления путем погружения в микросхему двухкомпонентной этанольного раствора тиола, состоящий из 3: отношение SH- 1 (СН 2) 8 -eg 3 -OH (СПО) и компонент либо амином или карбоксильную функциональную группу, а именно, SH- (СН 2) 11 -eg 3 -NH 2 (SPN) или SH- (СН 2) 11 -СООН -eg 3 (SPC). Оставьте Chip Мнеп тиольное решение O / N, чтобы сформировать самоорганизующуюся монослой (SAM). Промойте чип с этанолом и сухой с азотом. При необходимости хранить функционализированный чип до 2 недель при 4 ° С. Готовое реагировать SPN или SPC компонент с лигандом с использованием химии в зависимости от лиганда выбора (см. Ниже) Примечание: чипы можно регенерировать и повторно функционализирован десятки раз. Данный чип может быть использован для периодов, которые варьируются от 6 месяцев до более года. Спектры измерены на данном массиве надежно воспроизводятся после неоднократных регенерации по плазменной озоления с последующим biofunctionalization. 29 3. Поверхность Функционализация и Кинетическая характеристика Примечание: Используйте функционализированную чип в коммерческом SPR инструмента охарактеризовать кинетические константы скорости между лигандом и анализируемым, а также для изучения сопротивления SAM неспецифической бinding. Существует широкий диапазон скоростей потока и микрофлюидных конструкций, которые позволяют для эффективного поверхности функционализации. Так как мы имеем в продаже SPR мы стандартизированы вокруг своих рекомендованные расхода. Отметим, что эти скорости потока характерно для всех СРП инструментов и так не являются ограничительными. ППР инструмент не является необходимостью, так как все функционализации может быть сделано непосредственно на чипе LSPR, но это сократить рабочую нагрузку, потому что это мультиплексный инструмент в то время как наша LSPR Микрожидкостных установки нет. Функционализировать коммерческий голый золотую фишку с SAM, как описано в разделе 2. При использовании на основе SPC SAM, активировать карбоксильную группу с 1: 1 смесью 133 мМ 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) и 33 мМ N -hydroxysuccinimide (NHS) в DDW в течение 10 минимум Проспрягайте активированную карбоксильную группу с антителом / интересующего лиганда на 300 сек при скорости потока 30 мкл / мин. Подготовка лигандов врН 6 фосфатный буфер, как правило,, но это может варьироваться в зависимости от молекулы. После конъюгации лиганда, расход 0,1 М этаноламин в фосфатно-солевом буфере (PBS) в качестве шага деактиватора на 300 сек при скорости 30 мкл / мин. Этаноламин помогает свести к минимуму неспецифическое связывание. Представьте анализируемого вещества при скорости потока 100 мкл / мин с использованием диапазона концентраций и расчета кинетических констант скорости, используя программное обеспечение кинетический анализ. Если неспецифическое связывание проблематично, увеличить соотношение SPO в SPC или SPN. 4. LSPR Общие настройки Настройки Микроскоп: Используйте 100 Вт Галогенные лампы для освещения Келера образца. Используйте длинный фильтр (обычно 593 нм отсечки) на пути света, чтобы устранить длины волн, которые не вносят вклад в резонансной сдвига (рис 2). Для сбора данных LSPRi, использовать инвертированный микроскоп с 40х нефти immersioп цель (1,4 НС) и термоэлектрическим охлаждением 16 бит ПЗС-камеры. Поместите светоделитель на выходной порт микроскопа, чтобы получить снимки и спектры одновременно. Установите контролем температуры микроскопа этап до 37 ° C и уравновешивают в течение 4 ч. Включение дополнительного узла инкубации на микроскопе, чтобы регулировать концентрацию CO 2 и влажности на уровне 5% и 95%, соответственно. Подготовка Чип и монтаж: Функционализировать чип LSPR, как описано в разделе 2 с оптимальными двухкомпонентных SAM соотношениях, определяемых из СРП экспериментов. Загрузите чип в выполненного на заказ микрожидкостных держателя следующим образом. Поместите фишку на алюминиевой нижней части. Бутерброд чип между этой нижней части и силиконовой прокладкой и прозрачной пластиковой верхней части. Используйте 4 винта, чтобы зафиксировать узел. Для типичного SPC-приложение, тиол, капельный слой 300 мкл смеси 1: 1 смесира 133 мМ EDC и 33 мМ NHS в DDW, чтобы активировать карбоксильные группы компонента НПЦ тиольного. Подождите в течение 10 мин и вручную промыть поверхность 10 мМ PBS. Проспрягайте активированную карбоксильную группу с лигандом (обычно это антитело или фрагмент антитела), представляющие интерес по капли покрытия 300 мкл раствора лиганда. Подождите в течение 30 мин и вручную промыть 10 мМ PBS. Капельный слой 300 мкл 0,1 М этаноламина в PBS на чипе, чтобы минимизировать неспецифическое связывание. Подождите в течение 10 мин. Промыть этаноламин ФБР, содержащим 0,005% Tween 20 (PBS-T20). Поместите кусок кварца выше чипа, чтобы уменьшить колебания в данных, относящихся к меняющуюся мениска. Держите чип мокрый с PBS-T20 буфера при монтаже на микроскопе. Поместите чип сборки LSPR твердо в нагретой держателя образца этап и приложите микрожидкостных трубки. Прикрепите Microfluidics шланги к сборке и бу потокаffer (или сыворотки свободных средств массовой информации для сотовых исследований) до стационарного состояния достигается. Дайте сборки и микроскоп для уравновешивания в течение, по меньшей мере 2 ч. Совместите чип, используя джойстик так, чтобы центральная массив в соответствие с волоконно-оптической спектроскопии. Спектроскопические данные берутся с помощью спектрометра и программное обеспечение спектрального анализа. Держите массивы в фокусе в течение всего эксперимента с помощью программного обеспечения автофокус, Zeiss выдержка Фокус или эквивалентную автофокусом устройство. 5. LSPR изображений анти-с-Мус выделениями из 9Е10 клеток гибридомы Примечание: Линия клеток гибридомы использовали для этого исследования выражают анти-с-Myc антитела конститутивно и, следовательно, не требуют химической триггер Функционализировать наноструктур с с-Мус пептида. Это имеет значение K D 1,77 нм для анти-с-Myc антител, секретируемых клон 9Е10 клеток гибридомы. Культура клеток гибридомы в Completе ростовой среде с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотика в Т75 колбы при 37 ° С в 5% СО 2. Поддержание плотности клеток 4 × 10 5 клеток / мл. Для секреции клеток исследований, на пеллетах клетки из Т75 колбы путем центрифугирования, дважды промывали средой RPMI-1640, свободных средств массовой информации в сыворотке крови (SFM), чтобы удалить выделяемые антитела и регулировать плотность клеток до 4 × 10 6 клеток / мл. Урожай клетки и тест на жизнеспособность до введения их в на LSPR чипов. Введение 50 мкл раствора клеточной вручную на чипах LSPR с помощью микропипетки. После нескольких минут от 25 до 50 клетки прилипают к поверхности чипов LSPR. Смыть оставшиеся клетки в растворе свежей SFM с помощью микрожидкостных системы перфузии. Выберите массивы LSPR для визуализации, которые близки, в течение 10 мкм, но не дублируют друг друга с клетками. Чтобы гарантировать, что сигнал является специфичным для секретируемого анти-с-Мус Антибodies ввести культуры клеток с и без антител, присутствующих, а также с антителами, но с их сайтов связывания заблокированных присутствии концентрации насыщающего с-Мус пептида в растворе. Калибровка датчиков в конце каждого прохода с насыщающей раствора анти-с-Myc антител (250 нм). Это помогает в нормализации реакцию датчиков и определить дробного заполнения на основе biofunctionalization профиль каждого прогона. Исправьте дрейф в X и Y направлении, используя выравнивание изображения программное обеспечение.

Representative Results

В типичной живой клетки исследования секреции есть несколько режимов сбора данных происходит. На рисунке 3 показан накладку на LSPRi образ, который подчеркивает квадратные массивы, и освещается в проходящем свете изображение, которое подчеркивает ячейку в левом нижнем углу. Данные обычно собираются в течение 3-ч с последующим введением раствора насыщающего аналита для расчета нормализации, описанного ниже. Флуоресцентный изображений также может быть интегрирован в процедуру сбора данных автоматизированной коммутации куба фильтра. На рисунке 4 клетке окрашенных флуоресцентным красителем родамин мембраны DHPE проявляет ламеллиподий, как расширения (стрелки). Если такие расширения были пересекаться с массивами они дать ложно-положительный результат на секрецию белка. Наличие нескольких режимов съемки могут помочь выявить такие случаи. Рисунок 5 показывает спектрометрии данные до и кормеэр введение раствора насыщающего (400 нМ) купленных анти-с-Myc антитела к С-Myc функционализированных массивов. Клетки не присутствовали в этом эксперименте. Спектр отображает как красное смещение и увеличение интенсивности. Разница между площадей под двумя кривыми приводит к увеличению интенсивности изображения в режиме массива LSPRi на ПЗС-камеры. Нелинейная подход мере анализа данных площадей была разработана, чтобы вывести дробную размещение поверхностных лигандами из спектров. 30,31 В конце эксперимента, значения насыщенный интенсивности (т.е. дробно размещение ≈ 1) используются для вычисления нормализованной ответ для каждого массива, используя следующую формулу: Где нормированная интенсивность в момент времени Т, начальная интенсивность в начале эксперимента, конечный насыщенного интенсивности и измеренная интенсивность массива в момент времени T </eм>, соответственно. Нормированные значения от двух массивов показано на фиг.6. Один массив был в пределах 10 мкм клетки под следствием то время как другие, использовали в качестве контроля, были расстоянии 130 мкм от клетки. Внезапное увеличение в нормализованном ответ массива ближайшего к клеточной по отношению к плоской характеристикой массива управления указывает на локализованной вспышке секретируемых антител. Рисунок 1. Датчик дизайн. Рисунок с изображением геометрию типичного эксперимента живой клетки секреции. Ячейки (синий сфероид) наносят на чип к LSPR который содержит массивы золота biofunctionalized наноструктур. В увеличенного изображения, клеточной секреции интерес, в данном случае, как антител, показанных Y-образный молекул, измеряется как они связываться с поверхностьюфункционализованного наноструктур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Оптическая установки. Светящаяся свет от галогенной лампы сначала фильтруется долго фильтра (LP). Свет линейно поляризованным (Р1) и освещает образец с помощью 40X / 1.4 Н.А. цели. Рассеянный свет собирали целью и пропускают через скрещенные поляризатор (Р2). Разветвитель 50/50 луча (БС) вставляется в пути света, собранной для одновременного анализа спектроскопических и образов. Вверху справа:. Атомно-силовой микроскопии изображение 9 отдельных наноструктур, разделенных шагом 300 нм Пожалуйста, нажмите здесьЧтобы смотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3. Живая сотовый LSPRi Исследование. Объединенный проходящего света и LSPRi изображение, показывающее один клетки гибридомы (внизу слева), окруженный 12 массивов. Это контраст улучшенное изображение. Масштабная линейка составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4. живых клеток флуоресценции исследования. Флуоресцентный ложное цветное изображение из одного гибридомной клетки окрашивают родамин-DHPE, что мембрана краситель. В люминесцентной режиме визуализации массивов как правило, не видны, однако, поблизости массив наблюдается здесь ABне хватает площади в правом нижнем углу. Клетка может быть видно, чтобы отделить от массива, хотя щупальца, как расширений (возможно филоподий или ламеллиподий) оказываемое наружу из клеток (стрелки). Масштабная линейка составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5. Спектральный модальности. Спектры, полученные из С-Myc функционализированного массива до и после введения 400 нм раствора анти-с-Myc антител. Нет клетки не были представлены в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. <img alt="Рисунок 6" src= "/ файлы / ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg" /> Рисунок 6. Single Cell секреции. Ответ из массива, расположенного в 15 мкм одной клетки и одного расположенного 130 мкм от (контроль). Масштабная линейка составляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.^7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.

There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.

The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.³³ Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have nothing to disclose.

Materials

25mm diameter glass coverslips	Bioscience Tools	CSHP-No1.5-25	170±5 µm is optimal
Poly-methyl methacrylate	Microchem	PMMA 950 A4
Ethyl lactate methyl metacrylate	Microchem	MMA EL6
Electron beam evaporator	Temescal	FC-2000
Electron beam lithography	Raith	Series 150
Ethanol	Sigma-Aldrich	459836
Acetone	Sigma-Aldrich	320110
CR-7 chromium etchant	Cyantek	CR-7
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 55
Atomic force microscope	Veeco	Nanoscope III
Plasma ashing system	Technics	Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)	Prochimia	TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)	Prochimia	TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)	Prochimia	TH 002-m11.n3-0.2
Surface plasmon resonance system	Biorad	XPR36
Bare gold chip	Biorad	GLC chip	Plasma ashed to remove the monolayer
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide	Thermo	22980
N-hydroxysuccinimide (NHS)	Thermo	24510
Pentylamine-Biotin	Thermo	21345
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Neutraavidin	Thermo	31000
Phosphate buffered saline	Thermo	28374
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
Inverted microscope	Zeiss	Axio Observer	Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH
CCD camera	Hamamatsu	Orca R2	Thermoelectrically cooled (16 bit)
Spectrometer	Ocean Optics	QE65Pro
Spectrasuite	Ocean Optics	version1.4
c-myc peptide HyNic Tag	Solulink	SP-E003
monoclonal anti-c-myc antibody	Sigma-Aldrich	M4439
Hybridoma cell line	ATCC	CRL-1729
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
Serum free media RPMI 1640	Invitrogen	11835-030
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Rhodamine DHPE	Life Technologies	L-1392

Referanslar

Ludwig, A. -. K., Giebel, B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).
Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).
Letterio, J. J., Roberts, A. B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).
Werner, S., Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).
Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).
Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).
Gazagne, A., et al. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).
Han, Q., et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).
Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).
Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).
Shirasaki, Y., et al. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).
Milgram, S., et al. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).
Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).
Ermakova, A., et al. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).
Haes, A. J., Van Duyne, R. P. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).
Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).
Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).
Barbillon, G., et al. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).
Endo, T., et al. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).
Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).
Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer’s disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).
Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).
Park, J. H., et al. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A.. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).
Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).
Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).
Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).
Oh, B. R., et al. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).
Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).
Raphael, M. P., et al. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).
Raphael, M. P., et al. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).
Raphael, M. P., et al. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).
Henn, A. D., et al. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).
Bramswig, K. H., et al. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Kanser Araştırmaları. 73, 6584-6596 (2013).

Etiketler

Label-free Single Cell Secretions Localized Surface Plasmon Resonance Imaging (LSPRi)Protein Secretion Cell-to-cell Signaling Nanofabrication Biofunctionalization Binding Kinetics Live Cell Imaging

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Raghu, D., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Byers, J. M., Raphael, M. P. A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions. J. Vis. Exp. (105), e53120, doi:10.3791/53120 (2015).