We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.
Fluorescentie-gemedieerde tomografie (FMT) maakt langs- en kwantitatieve bepaling van de fluorescentie distributie in vivo en kan worden gebruikt om de biodistributie van nieuwe probes te evalueren en aan ziekteprogressie bepalen gebruikmakend van gebruikelijke moleculaire probes of reportergenen. De combinatie met een anatomische modaliteit, bijvoorbeeld micro computed tomography (μCT), is gunstig voor beeldanalyse en fluorescentie reconstructie. We beschrijven een protocol voor multimodaal μCT-FMT beeldvorming waaronder de beeldverwerking stappen die nodig zijn om kwantitatieve metingen te extraheren. Na bereiding van de muizen en het uitvoeren van de beeldvorming worden de multimodale datasets geregistreerd. Vervolgens wordt een verbeterde fluorescentie reconstructie uitgevoerd, die de vorm van de muis uiting komen. Voor kwantitatieve analyse worden orgaan segmentatie gegenereerd op basis van de anatomische gegevens in onze Segmentation tool. Tenslotte, de biodistributie curves worden gegenereerd onder toepassing van een batch-verwerking functie. We tonen de toepasbaarheid van de werkwijze door beoordeling van de biologische verdeling van een bekende probe die bindt aan botten en gewrichten.
Fluorescentie-gemedieerde tomografie, ook wel moleculaire fluorescentie tomografie (FMT), is een veelbelovende techniek om kwantitatief de fluorescentie verdeling diffuse weefsels, zoals verdoofde muizen of menselijk lichaamsweefsel, bijvoorbeeld borsten of vingergewrichten beoordelen. In tegenstelling tot niet-invasieve microscopische technieken, die beeldvorming van oppervlakkige doelen op subcellulaire resolutie 1 toestaan, FMT maakt driedimensionale reconstructie van fluorescerende bronnen in diepte van enkele centimeters, zij het op een lagere resolutie 2. Vele specifieke fluorescerende probes zijn beschikbaar voor het angiogenese, apoptosis, ontsteking, en andere 2-5. Sommige probes zijn activeerbaar, bv door specifiek enzym splitsing leidt tot unquenching van fluorochromen.,. Bovendien kunnen reportergenen tot expressie fluorescerende eiwitten worden afgebeeld, bijvoorbeeld tumor celmigratie 6 volgen.
FMT profiteert sterk van de combinatie met een anatomische modaliteit, bijvoorbeeld μCT 2,7 of MRI 8. Terwijl de stand-alone FMT apparaten zijn in de handel verkrijgbaar 9, de fluorescentiebeelden moeilijk te interpreteren zonder anatomische referentiegegevens. Onlangs waren we in staat om aan te tonen, dat de gesmolten anatomische beeldgegevens maakt een meer robuuste analyse 10. De anatomische gegevens kunnen ook worden gebruikt om voorkennis verschaffen, zoals de buitenvorm van de muis, wat belangrijk is voor nauwkeurige optische modellering en fluorescentie reconstructie 11. Bovendien kan de optische verstrooiing en absorptie kaarten worden geschat met behulp van segmentatie van soorten weefsel en door het toekennen van klasse specifieke coëfficiënten 12,13. Voor nabij-infrarood licht, hemoglobine de voornaamste absorber in muizen, behalve melanine en bont 14. Aangezien de relatieve bloedvolume wordt regionaal door ordes van grootte, een absorptie kaart is vooral belangrijk voor Quantieve fluorescentie reconstructie 13.
Een voordeel van het gebruik van niet-invasieve beeldvorming is dat de muizen in langsrichting kan worden afgebeeld, dat wil zeggen op verschillende tijdstippen. Dit is belangrijk om het dynamische gedrag van probes, dat wil zeggen hun doel accumulatie, biodistributie en excretie 10,15 beoordelen of de ziekteprogressie 16 beoordelen. Bij beeldvorming verschillende muizen op verschillende tijdstippen, een grote hoeveelheid afbeeldingdatareeksen ontstaat. Om de vergelijkbaarheid mogelijk te maken, moeten deze worden verworven op een systematische manier, dat wil zeggen, met een goed gedefinieerd en gedocumenteerd protocol. Het grote aantal scans vormt een uitdaging voor beeldanalyse, die nodig is om kwantitatieve metingen van de beelddata te extraheren.
Het doel van ons onderzoek is om een gedetailleerde beschrijving van een μCT-FMT imaging protocol dat we hebben gebruikt en geoptimaliseerd in de hele verschillende studies 10,13,15,17,18. We beschrijvenhoe de datasets gegenereerd, verwerkt gevisualiseerd en geanalyseerd. Dit wordt gedemonstreerd met behulp van een gevestigde moleculaire probe, OsteoSense, dat bindt aan hydroxyapatiet 19 en kan worden gebruikt om beelden botziekten en remodellering 2. Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de overheid toetsingscommissie op dierlijke zorg.
We beschrijven en een protocol toe te passen voor multimodaal μCT-FMT beeldvorming. We maken gebruik van in de handel verkrijgbare en op grote schaal gebruikt FMT en μCT apparaten 3,11,15 – 17,21. Terwijl het protocol vereist een specifieke FMT kan de μCT worden vervangen door een ander μCT met gelijke functionaliteit en vergelijkbare scanparameters, bijvoorbeeld moet het gezichtsveld groot genoeg om de muis bed waaronder merkers dekken.
De FMT is gebruikt voor biodistributie analyse, zonder combinatie met μCT of MRI 21, maar de anatomische gegevens gunstig om de reproduceerbaarheid te verhogen omdat de segmentering kan worden gebaseerd op het orgaan begrenzingswanden die zichtbaar is in het μCT data 10 zijn. Hoewel geïntegreerde μCT FMT-inrichtingen ontwikkeld 2,7, deze nog niet commercieel beschikbaar. Verder is het gebruik van twee afzonderlijke inrichtingen toestaat piping, dwz., De volgende muis can worden afgebeeld in de μCT terwijl de eerste muis nog in de FMT, om de doorvoer te verhogen.
Om de handmatige werklast te verminderen, voeren we automatische marker detectie en fusion. Bovendien wordt de muis vorm automatisch gesegmenteerd en deze informatie verbetert de fluorescentie reconstructie 11,13,22. Voor kwantitatieve fluorescentie wederopbouw, zijn absorptie en verstrooiing kaarten nodig 13,23. We leiden de verstrooiing kaart door automatische segmentatie van de μCT gegevens en toewijzen van bekende verstrooiing coëfficiënten van meerdere weefseltypen (longen, bot, huid, vet en overige weke delen) 24. Vervolgens reconstrueren een absorptie map van de optische ruwe gegevens hetgeen vooral van belang voor goed doorbloede organen zoals het hart en de lever 13,20.
Scannen verschillende muizen op verschillende tijdstippen snel resulteert in een groot aantal gegevens te analyseren. Voor biodisbijdrage studies, moeten verscheidene organen worden gesegmenteerd voor elke μCT FMT-scan. Helaas kan de segmentaties niet opnieuw worden gebruikt, omdat de muis is onlangs geplaatst in de muis bed herhaaldelijk. We maken gebruik van een hulpmiddel voor interactieve segmentatie, ontwikkeld in ons instituut, maar andere instrumenten zou ook geschikt 25 zijn. We genereren voxel-wise segmentaties, omdat deze wedstrijd beter om complexe organen dan eenvoudige vormen, zoals ellipsen en kubussen 26. Geautomatiseerde hele dier segmentatie zou nuttig zijn om de handmatige werkdruk 27 verder te verminderen, maar een interactief segmentatietool nog steeds nodig om te corrigeren voor segmentatie fouten. Verder kunnen geautomatiseerde segmentatie gereedschappen nauwelijks anticiperen op bijzondere gevallen, zoals pathologieën correct. Omdat we natieve μCT scans bepaalde organen zoals de milt zeer moeilijk segment zelfs handmatig. Contrastmiddelen zou helpen, maar dit met tolerantie en het is moeilijk om maintaina een gestage contrastmiddel verdeling in de longitudinale beeldvorming.
Onze phantom studie toont aan dat het signaal lokalisatie verbeterd bij gebruik van de vorminformatie voor fluorescentie reconstructie. In vivo een vergelijkbare verbetering is evident voor de vroege tijdstip (15 min na injectie), wanneer een grote hoeveelheid van de probe is reeds in de urineblaas. De hydroxyapatiet bindende probe accumuleert op botten en gewrichten. Opvallend is hoe snel dit gebeurt, namelijk het signaal al duidelijk op de rug 15 min na injectie. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door het lage molecuulgewicht van de probe, die een snelle extravasatie en diffusie zorgt de doelgebieden. De sonde bindt covalent aan zijn doel hydroxyapatiet en de ongebonden sonde wordt uitgescheiden. Voor de latere tijdstippen tussen 6 uur en 24 uur na injectie, de signaalintensiteit in de rug blijft relatief stabiel, waarschijnlijk omdat nauwelijks licht datpijn diep in de muis om de fluorescentie bleken. Voor ons onderzoek gebruikten we de 750 nm kanaal, waardoor lage achtergrondfluorescentie als evident voor de vóór injectie verkregen scans. Bij lagere golflengten, kan meer achtergrondinformatie signaal worden verwacht 28.
Samengevat beschrijven we een multimodale imaging protocol voor in de handel verkrijgbaar FMT en μCT apparaten. We tonen aan dat de combinatie levert voordelen op fluorescentie reconstructie. We illustreren de biodistributie curves van de grote hoeveelheid gegevens worden geëxtraheerd door middel van interactieve organen segmentatie en batchverwerking. We geloven dat deze gestandaardiseerde workflow nuttig voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en andere beeldvormende studies met behulp van fluorescent gelabelde probes kunnen zijn.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Marek Weiler voor het uitvoeren van het fantoom experimenten. Dit werk werd ondersteund door de European Research Council (ERC Starting Grant 309.495: NeoNaNo), de Duitse deelstaat Noordrijn-Westfalen (NRW, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), de Duitse Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) (financieringsprogramma's Virtual Lever (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), de RWTH Aachen University (I 3 TM Seed Fund), en Philips Research (Aken, Duitsland).
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |