Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em> Xenopus</em> Embryo's van Chip-Seq

OPMERKING: Alle Xenopus werk voldoet volledig aan de Britse Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 zoals uitgevoerd door de MRC National Institute for Medical Research. 1. Voorbereidingen Schatting van het aantal embryo's die nodig zijn voor de chip-experiment (zie bespreking). Bereid de volgende oplossingen worden bewaard bij kamertemperatuur 500 ml 10x Marc gemodificeerd Ringers (MMR) zonder EDTA, pH 7,5 en in de autoclaaf (1 M NaCl, 20 mM KCI, 20 mM CaCl2, 10 mM MgSO4, 50 mM HEPES pH 7,5) 10 1 ml SDS elutiebuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1% SDS) en 1 ml 5x DNA laadbuffer (0,2% Orange G, 30% glycerol, 60 mM EDTA pH 8,0). Bereid de volgende oplossingen worden bewaard bij 4 ° C 50 ml HEG buffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0, 20% glycerol), 500 ml extractiebuffers E1 (50 mM HEPES-KOH pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. 10% glycerol, 0,5% Igepal CA-630, 0,25% Triton X-100), E2 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA) en E3 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Igepal CA-630, 0,25% Na-deoxycholaat, 0,1% SDS), 500 ml RIPA-buffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 500 mM LiCl, 1 mM EDTA , 1% Igepal CA-630, 0,7% Na-deoxycholaat) en 50 ml TEN buffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl). Score en clip een 15 ml conische polystyreen buis aan de 7 ml markering. Gebruik deze tube naar kernextracten ondergaan soniceren bevatten. Voor post-sequencing analyse, gebruik dan een multicore Unix-achtig computer met minstens 8 GB RAM en 500 GB vrije schijfruimte. Installeer de volgende software lokaal waarvan de meeste worden gebruikt op de opdrachtregel: FastQC, Illumina Casava-1.8 kwaliteit filter, Bowtie 11, SAMtools 12, Homerus 13, MACS2 14, IGV 15,16, Cluster3 17, Java TreeView, BLAST + 18, en b2g4pipe <sup> 19. Controleer de installatie-instructies en eisen voor compilers en software van derden. Bouw een Bowtie index voor het uitlijnen van korte NGS leest de Xenopus genoom. Een voorbeeld is hier te zien voor de X. tropicalis genoom v7.1 (november 2011), die kan worden gedownload als een FASTA bestand (genome.fa) uit de Xenbase ftp server (/ pub / Genomics / JGI). Verplaats de FASTA bestand naar de index subdirectory van Bowtie. Gebruik de volgende opdrachtregel (hier na de prompt teken>) om xenTro7 index bestanden te genereren: > /path/to/bowtie/index/genome.fa Bowtie-build xenTro7 > Export BOWTIE_INDEXES = / pad / naar / bowtie / index / Download het gen annotatie bestand (GTF) van de UCSC Genome Browser of de mirror site op het NIMR server voor de meest recente genoom versies (genomes.nimr.mrc.ac.uk) via Extra / Table Browser. Gebruik het genoom FASTA bestand en de GTF bestand naar H aanpassenOMER voor Xenopus (bv X. tropicalis genoom v7.1, – noem xenTro7). U kunt ook vooraf gebouwde HOMER pakketten voor sommige oudere versies van de Xenopus genoom. > LoadGenome.pl -name xenTro7 -org null -fasta /path/to/genome.fa -gtf pad / naar / genes.gtf Maak een genoom track (.genome-bestand) voor het genoom browser IGV door het uploaden van een geïndexeerde FASTA bestand (genome.fa met genome.fa.fai bestand in dezelfde map) en de annotatie bestand (genes.gtf). Maak een genoom steiger index (genome.fa.fai) voor de Xenopus genoom als volgt: > Samtools faidx /path/to/genome.fa Gebruik BLAST + naar Gene Ontology (GO) termen als volgt overgaan van verschillende model soorten (mens, muis, zebravis, fruitvlieg en gist) op Xenopus genen: Download alle coderende sequenties (CDS) als een enkele FASTA bestand (cds.fa) van de UCSC Genome Browser via Extra/ Table Browser en updaten BLAST + met de pre-geformatteerde BLAST databank van niet-redundante eiwitten (nr): > Update_blastdb.pl nr Zoeken naar mens (txid9606), muis (txid10090), zebravis (txid7955), fruitvlieg (txid7227) en gist (txid4932) eiwitten uit de NCBI site via de geavanceerde zoekfunctie (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov / eiwit / geavanceerd) en stuur de resulterende GI (sequence identifier) ​​lijst (sequence.gi.txt) op de computer. Toewijzen Xenopus genen om de meest gelijkaardige proteïnen uit de GI lijst door het uitvoeren van BLASTX met een zekere verwachten (E) waarde cutoff (hier 10 -20). Zorg ervoor dat de output formaat is xml (-outfmt 5 uitchecken blastx_results.xml). Maak gebruik van tijdbesparende draden (-num_threads), die correleren met het aantal beschikbare computer kernen. > BLASTX -db / pad / naar / nr -gilist /path/to/sequence.gi.txt -query / pad / to / cds.fa -evalue 1e-20 -outfmt 5 uitchecken /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# discussies] Open het b2gPipe.properties bestand van de map b2g4pipe met een tekstverwerker en bijwerken van de database-eigenschappen te Dbacces.dbname = b2go_sep13 en Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. Ren b2g4pipe uit de installatiemap. > Java Xmx1000m -cp *: ext / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -in /path/to/blastx_results.xml uitchecken resultaten / xenTro7 -prop b2gPipe.properties -v -annot NB: Dit programma extracten GO termen voor elke BLAST geraakt en wijst ze toe aan overeenkomstige Xenopus genen (xenTro7.annot). De meest actuele database-instellingen kunt u vinden onder Extra / Algemene instellingen / DataAccess instellingen van de applicatie Blast2GO Java Web Start (zie 9.11.1). 2. Chromatin Cross-linking Bevruchten Xenopus eieren, de-gelei en cultuur embryos volgens standaardprotocollen 20. Breng de dejellied embryo's (maximaal 2.500 X. laevis of 10.000 X. tropicalis) bij het ​​ontwikkelingsstadium van belang zijn voor een 8 ml glazen monster flesje met dop en was ze een keer kort met 0.01x MMR. Bevestig het embryo met 1% formaldehyde in 0.01x MMR (bijv voeg 225 ul van 36,5-38% formaldehyde tot 8 ml 0.01x MMR) gedurende 15 tot 40 min bij kamertemperatuur (zie bespreking voor de fixatie en het aantal embryo vereist per chip experiment). OPMERKING: Formaldehyde is corrosief en zeer giftig. Het is gevaarlijk in geval van contact met ogen en huid, indigestie, en inhalatie. Gebruik de zuurkast bij het toevoegen van formaldehyde aan de flacon. Stop de fixatie door kort wassen van de embryo's drie keer met koude 0.01x MMR. Laat je niet embry os maken contact met de vloeistof oppervlak, omdat de oppervlaktespanning zorgt ervoor dat ze scheuren. Aliquot de embryo's in 2 ml microcentrifugebuisjes op ijsmet een maximum van 250 embryo's per buis, die een volume van ongeveer 250 ul (X. tropicalis) of 600 pl (X. laevis) voor het uitkomen bezetten. Pipet weg zoveel 0.01x MMR mogelijk. Sla de volgende stap over als u onmiddellijk verder met deel 3. Equilibreer embryo in 250 ui koude HEG buffer. Nadat de embryo's hebben zich op de bodem van de buis te verwijderen zoveel vloeistof mogelijk en snap-vries in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 ° C. 3. Chromatin Extraction Opmerking: De volgende extractie verknoopt chromatine van Xenopus embryo meest efficiënt met fixatietijden aangegeven in stap 2.3 en 50 tot 80 X. tropicalis of 25-40 X. laevis embryo's per ml extractiebuffer E1, E2 en E3. Elke extractiestap wordt herhaald, zodat dubbele berekende hoeveelheid buffer nodig. Voor opschaling, gebruik van meerdere 2 ml microcentrifuge buizen of 50 ml centrifugebuizen. Houd monsters en buffers op het ijs tijdens de chromatine extractie. Supplement voldoende hoeveelheden buffers E1, E2 en E3 met 1 mM DTT en proteaseremmers tabletten. Als uitvoeren ChIP met een fosfo-specifiek antilichaam, verdere toeslag buffers met 5 mM NaF en 2 mM Na 3 VO 4. Homogeniseren vaste embryo's met E1 op en neer te pipetteren. Centrifuge homogenaten in een gekoelde centrifuge (4 ° C) bij 1000 xg gedurende 2 minuten (of 5 min bij toepassing van 50 ml buizen). Zuig het supernatant en eventuele lipiden aan de muur. Resuspendeer pellets E1. Houd monsters op ijs gedurende 10 minuten. Centrifuge en gooi bovenstaande vloeistoffen zoals in stap 3.2. Resuspendeer pellets E2. Centrifuge en gooi bovenstaande vloeistoffen zoals in stap 3.2. Herhaal stap 3.4, maar houd monsters op ijs gedurende 10 minuten vóór het centrifugeren. Resuspendeer pellets in E3. Houd monsters op ijs gedurende ten minste 10 minuten. Centrifuge en gooi supernatants zoals in stap 3.2. Opmerking: In dit stadium moet de resuspensions vrij transparant worden. De anionische detergentia E3 extract verknoopt kernen door rendering meeste resterende dooier bloedplaatjes oplosbaar. Resuspendeer en pool pellets verknoopt kernen (gewoonlijk gekleurde bruin uit het onoplosbaar pigmentkorrels) in een totaal volume van 1 ml E3. Verdun het monster met E3 2 of 3 ml indien blijkt zeer viskeus en moeilijk te pipetteren. Houd op ijs of bij 4 ° C om met stap 4 op dezelfde of volgende dag. Snap-bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C voor later gebruik. 4. Chromatin Fragmentatie OPMERKING: Sonicatie wordt zowel gebruikt om oplosbaar te maken en om cross-linked chromatine scheren. Hier zijn parameters om de Misonix Sonicator 3000 uitgerust met een 1/16 inch taps microtip en geluiddempende kap draaien. Bij gebruik van andere sonicators, volgt de aanbevelingen van de fabrikant voor afschuivingverknoopt chromatine of gebruik 6-12 W 4 tot 8 minuten in totaal. Breng de nucleaire monster uit stap 3.7 in een op maat gemaakte buis sonificatie (stap 1.4). Houd het gekoeld tijdens ultrasoonapparaat monster door het hebben van de buis bevestigd aan een 800 ml plastic beker gevuld met ijs water via een korte thermometer klem. Plaats het bekerglas op een laboratorium aansluiting. Stel de krik zodat de ultrasoonapparaat micropunt wordt ondergedompeld in het monster ongeveer tweederde van het volume diepte en gecentreerd zonder de buiswand raken. Ultrasone trillingen het monster gedurende 7 minuten in totaal, onderbroken elke 30 sec met 1 min pauzes. Stel kracht tot 1,0. Start de geluidsgolven en onmiddellijk verhogen van de energie-instelling (normaal 2-4) om een ​​lezing van 9 tot 12 W. als het monster begint te schuimen onmiddellijk Pauze bereiken. Herpositioneren buis en opnieuw opstarten wanneer het schuim volledig is verdwenen. Breng de geschoren chromatine in de pre-gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuizen en draaien op volle snelheid (> 15,000 x g) gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng de bovenstaande pre-gekoelde 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Verzamel 50 pl van het supernatant (idealiter met de chromatine van ongeveer 400.000 of meer kernen) de mate van chromatine fragmentatie (punt 5) zichtbaar. Gebruik voor chip (hoofdstuk 6) de rest van de bovenstaande vloeistof. WINKEL monsters bij 4 ° C gedurende maximaal één dag. Snap-vries monsters aliquots (één per ChIP experiment) in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -80 ° C. 5. Imaging Chromatin Fragmentatie Voeg 50 ui SDS elutiebuffer, 4 pl 5 M NaCl en 1 pl proteinase K (20 ug / ul) 50 pl van het supernatant van stap 4.6. Incubeer gedurende 6 tot 15 uur (O / N) in een hybridisatie oven op 65 ° C. Zuiver DNA met een commercieel PCR zuivering kit. Indien nodig 3 M natriumacetaat (pH 5,2) om de pH zoals aanbevolen door de fabrikant. Elueren deDNA tweemaal met 11 ui elutiebuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,5). Voeg 0,4 gl RNase A (20 ug / ul) en 5 pl 5x DNA laadbuffer voordat u het gehele monster naast een 100 bp en een 1 kb DNA ladder op een 1,4% agarosegel door elektroforese. Voor een optimaal resultaat, vlek gel met een veilige nucleïnezuur kleuroplossing na elektroforese. 6. Chromatine Immunoprecipitatie OPMERKING: In dit gedeelte gebruiken low-retentie 1,5 ml microcentrifugebuizen en ten minste 1 ml aangegeven buffer per buis aan magnetische beads wassen gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Alvorens de buffer van de bolletjes, laat de buizen in de magnetische rek voor 20 tot 30 seconden per tijd of totdat de oplossing helder is. Transfer 10 tot 30 pi van het supernatant (afgeschoven chromatine) vanaf stap 4.6 een nieuwe buis later als input sample, wat overeenkomt met ongeveer 1% van de totale chromatine gebruikt voor ChIP. Bewaren bij 4° C tot chip monsters zijn klaar voor het omkeren van cross-links. Breng de rest chromatine naar een nieuwe buis. Voor ChIP-qPCR experimenten vereisen een antilichaam controle, te distribueren gelijke volumes van chromatine tot twee buizen. Voeg de ChIP-grade antilichaam (of het overeenkomstige antilichaam controle) naar chromatine. Als een indicatie, gebruik maken van ongeveer 1 ug van antilichaam per een miljoen cellen die het epitoop van belang. Nauwkeuriger schatting van de hoeveelheid antilichaam nodig per chip experiment, rijden op de zelfde chip met verschillende hoeveelheden antilichaam (bv 0,25 ug, 1 pg en 2,5 pg) en vergelijk het rendement op de negatieve en positieve controle loci van Chip-qPCR (zie paragraaf 10). Als een antilichaam controle gebruikt normaal serum van hetzelfde isotype en gastheerdier soorten als het antilichaam. Incubeer op een rotator (10 rpm) O / N bij 4 ° C. Was voldoende hoeveelheid antilichaam-compatibele magnetische korrels eenmaal met E3 gedurende 5 min eent 4 ° C. Check specificatie van de fabrikant voor het antilichaam bindingscapaciteit van de korrels (meestal 5 tot 20 ui korrels binden 1 ug IgG-antilichaam). Voeg gewassen bolletjes aan het antilichaam gepreïncubeerd chromatine. Verder incuberen op een rotator (10 opm) gedurende 4 uur. Was kralen vier keer (CHIP-qPCR) of tien keer (ChIP-Seq) met pre-gekoelde RIPA buffer, en dan een keer met pre-gekoelde TEN buffer. Alleen het uitvoeren van deze stap als het uitvoeren van een chip-Seq experiment. Resuspendeer gewassen kralen in 50 ul van TEN buffer per buis. Pool alle kralen uit een enkele chip experiment door ze op een nieuwe buis. Met de magnetische rek en gekoelde (4 ° C) centrifugeren bij 1000 xg tot korrels te verzamelen op de bodem van de buis. Gooi zoveel vloeistof mogelijk zonder verstoring van de pellet van kralen. Strip ChIP materiaal van de korrels door resuspenderen van de korrels in 50 tot 100 ul SDS elutiebuffer en vortexing ze continu met een thermomixer (1000 rpm) gedurende 15 minuten bij 65 ° C. Daarna centrifuge op volle snelheid (> 15.000 xg) gedurende 30 sec. Breng de bovenstaande (CHIP eluaat) naar een nieuwe buis. Herhaal de laatste stap en combineer de chip eluaten. 7. Chromatin Reverse Cross-linking en DNA Purification Voeg genoeg SDS elutiebuffer het ingangsmonster (stap 6.1) om het volume van de chip monster, die 100 tot 200 gl (stap 6.10) te bereiken. Supplement zowel chip en inbreng monsters met 1/20 volume van 5 M NaCl. Incubeer de monsters gedurende 6 tot 15 uur (O / N) bij 65 ° C in een hybridisatie oven. Voeg 1 volume TE buffer en RNase A bij 200 ug / ml. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Voeg proteïnase K bij 200 ug / ml. Incubeer gedurende 2-4 uur bij 55 ° C. Zuiver DNA met fenol: chloroform: isoamylalcohol extractie gevolgd door ethanol precipitatie zoals eerder geschetst 9. Voor ChIP-Seq, voeg 32ui elutiebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) om de DNA pellet opgelost. Laat monsters op ijs gedurende 30 minuten zodat het DNA volledig is opgelost. OPMERKING: Commercieel PCR zuivering kit lagere DNA herstel, maar zijn handiger, en kan worden gebruikt voor ChIP-qPCR monsters. Voor ChIP-Seq, bepalen de concentratie van 1 pl van de chip en input DNA met behulp van-fluorometrie gebaseerde methoden. Volg de instructies van de fabrikant en controleer of de concentratie van DNA in betrouwbare detectiebereik van de fluorometer valt. 8. ChIP-Seq Bibliotheek Construction and Validation OPMERKING: Huidige werkwijzen voor DNA- bereiding bibliotheek laten constructie van hoge complexiteit bibliotheken NGS 1-2 ng. Ten koste nogal ingewikkeld kunnen bibliotheken worden gemaakt van slechts 50 pg DNA (zie Tabel van specifieke materialen / Apparatuur). Gebruik dezelfde hoeveelheid DNA voor zowel chip en input-bibliotheek. Kort make geïndexeerd (gepaarde-end) ChIP-Seq bibliotheken, chip en inbreng DNA moeten-end hersteld zijn, geligeerd aan speciale adapters (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur), op grootte geselecteerd en PCR versterkt. Volg de richtlijnen van de fabrikant om ChIP-Seq bibliotheken te maken. Zie de bespreking voor verdere aanbevelingen. Elueer elke bibliotheek in 12 ui elutiebuffer en het gehalte aan 1 ui van elke chip en input-bibliotheek met behulp van een fluorometer. Verwacht concentraties van 5 tot 25 ng / ul. Denk aan het verminderen van het aantal PCR-cycli (minder dan 18 cycli) als concentraties hoger dan 25 ng / ul. OPMERKING: Nauwkeurige kwantificering is essentieel voor de optimale NGS resultaten te bereiken. Bibliotheken met concentraties van slechts 1 ng / gl na 18 PCR cycli kunnen worden gesequenced, maar vaak zijn minder complex. Gebruik 1 ui van de bibliotheek naar het fragment grootteverdeling te bepalen en te controleren op eventuele adapter dimeer vervuiling (band rond 120 bp) door c-hip gebaseerde capillaire elektroforese. Herhaal de vaste fase omkeerbare immobilisatie zuivering met parels tot sample verhouding van 1: 1 (in plaats van 1,6: 1) indien de bibliotheek bevat adapter dimeren. Voeren qPCR op gevalideerde positieve en negatieve controle loci (zie paragraaf 10) om te controleren of gelijkaardige DNA verrijking trends voor en na de bibliotheek voorbereiding worden waargenomen. Submit kwaliteitscontrole goedgekeurd bibliotheken voor sequencing. 9. Post-sequencing Analyse en Data Visualization OPMERKING: Tegenwoordig NGS wordt vaak uitgevoerd door in-house of commerciële sequencing faciliteiten (zie bespreking voor sommige NGS richtlijnen) uitgevoerd. De standaard uitvoer zijn enkelvoudige of meervoudige gzip gecomprimeerde FASTQ bestanden (* .fastq.gz) het opslaan van miljoenen sequencing leest. Normaal gesproken, multiplex leest zijn al gescheiden op basis van hun index en elke lees- bevat een sequentie identifier en een kwaliteitscontrole score (Phred + 33 voor Illumina 1.8+) voor elke base oproep. Deze aanpak is hier slechts een van de vele manieren om NGS gegevens te analyseren. De lezer wordt aangemoedigd om te controleren of een van de volgende opdracht regels vereisen veranderingen als dit veld is snel voortschrijdende en updates worden regelmatig voorkomende. Aaneenschakelen-gzip gecomprimeerde FASTQ bestanden en controleren de kwaliteit van de sequencing data met behulp van de FastQC script. Voer deze en de meeste van de volgende opdrachten voor zowel de chip en inbreng sequencing data (Voorbeelden getoond ChIP) vanaf de terminal: > Cat /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz > Fastqc ChIP.fastq.gz OPMERKING: Ruwe data uit de succesvolle sequencing van een hoge complexiteit ChIP-Seq bibliotheek zouden de meeste tests moeten doorstaan. Mislukkingen zijn voornamelijk afkomstig uit arme sequencing runs en experimentele artefacten zoals bevooroordeeld PCR-amplificatie of besmetting adapter. Een zekere mate van duplicatie (redundantie) wordt verwacht als overbodig leest kan bonafide DNA verrijking vertegenwoordigen <sup> 21. Echter, men later beperken lezen labels – het 5 'of aflezen – één per basepaar te elimineren overtollige leest zonder de detectiegevoeligheid van pieken (stap 9.4) 21. Pre-proces sequencing data om de verontreiniging adapter te verwijderen (homerTools trimmen -3 <adaptorsequentie>) waardoor een mismatch (-mis 1). Gebruik de eerste 20 basen van het (geïndexeerd) adapter (5 'naar 3') proximaal aan het DNA-fragment van belang bij ligatie (getoond adapter in de tabel van specifieke materialen / Apparatuur vermeld). > Gzip -cd ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vN> ChIP.fastq > HomerTools trimmen -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis 1 -min 36 ChIP.fastq LET OP: Het verwijderen van gefilterde leest (N) is alleen nodig standaard in FASTQ bestanden gegenereerd door Illumina 1.8. Laat de fastq_illumina_filter commando (dwz. '| Fastq_illumina_filter -vN')Als een oudere versie dan 1,8 gegenereerd de volgorde identifier. Lijn voorbewerkte leest met de referentie genoom (xenTro7) met behulp van Bowtie. Alleen blijf unieke kaart gebracht leest (-m 1) met de standaardinstellingen, dwz maximaal twee mismatches in de eerste 28 bases en een totaal Phred + 33 kwaliteit score van alle mismatches per lezen van de maximale 70. Rapport uitlijning in SAM-formaat (-S) . Toename van het aantal megabytes per thread (–chunkmbs) als de brok geheugen is uitgeput: > Bowtie -m 1 -S -p [# discussies] –chunkmbs [bijvoorbeeld 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam OPMERKING: Bowtie verwacht Phred + 33 kwaliteitsscores standaard. Onder meer de optie – phred64-quals als het FASTQ bestand is gegenereerd met Phred + 64 kwaliteitsscores door Illumina ouder dan 1.8. Gebruik twee HOMER commando's om de uitlijning (SAM) bestand om te zetten in een bobo-bestand (.bw): > MakeTagDirectory chip / -Single -tbp 1 ChIP.sam > MakeUCSCfile chip /-bigWig / pad / naar / genome.fa.fai -fsize 1e20 -norm 1E7 -o ChIP.bw OPMERKING: De transformatie vereist het schavot index (genome.fa.fai) van de referentie-genoom (stap 1.8). Hier het profiel is beperkt tot één tag per basenpaar (-tbp 1) en genormaliseerd naar 10 miljoen leest (-norm 1E7). bobo is een van de favoriete formaat om dynamisch te visualiseren chromatine-profielen met een genoom browser zoals IGV (stap 9.12). Bepaal de verdeling tags (-d ChIP /) en genomisch oriëntatiepunten (bijvoorbeeld +/- 10 kb met 25 bp bakken, -SI Ze 20000 -hist 25), zoals de transcriptie start (tss, hier getoonde voorbeeld) en terminatie ( tts) sites. Voer het HOMER perl-script annotatePeaks.pl met Xenopus annotaties xenTro7 (stap 1.7): > AnnotatePeaks.pl tss xenTro7 -grootte 20000 -hist 25 -d chip /> ChIP_tagDensity.tss Vind significante pieken van DNA verrijking tussen chip(-t ChIP.sam) en Input (-c Input.sam) in de X. tropicalis genoom behulp MACS2 met een 1% FDR cutoff (-q 0,01) en DNA-fragmenten (na sonicatie) van 200 bp (–bw = 200) voor de modelbouw. Voeg de vlag –broad om dit command line als verwacht een brede spreiding van het chromatine kenmerk van belang, zoals histon merken of RNA-polymerase. > Macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM -n chip -g 1.4376e9 -q 0,01 –bw = 200 OPMERKING: Het effectieve grootte van de X. tropicalis genoom assemblage v7.1 is ongeveer 1437600000 bp (-g 1.4376e9). MACS2 genereert een BED-bestand (ChIP_peaks.bed) beroep doet pieken met hun genomische locaties. Vergelijk verschillende chromatine-profielen in de vorm van een geclusterde heatmap: Maak een tag distributie matrix van tag dichtheid directories van belang (-d chip / other_ChIP /) op MACS2 pieken (bv +/- 1 kb met 25 bp bakken, -grootte 2000 -hist 25 -ghist): > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -grootte 2000 -hist 25 -ghist -d chip / other_ChIP /> ChIP.matrix Gebruik de grafische gebruikersinterface van Cluster3 om ChIP.matrix bestand te uploaden en hiërarchisch clusteren deze tag dichtheden op basis van de minimale Euclidische afstand tot het dichtstbijzijnde zwaartepunt. Open het gegenereerde CTD bestand in Java TreeView aan de clustering te visualiseren. Vind nieuwe en voorheen bekend bindingsmotieven, die zijn verrijkt op de piek toppen +/- 100 bp (-grootte 200). Gebruik annotatePeaks.pl naar motief gebeurtenissen kaart te brengen en motief dichtheden plotten: > FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / -formaat 200 -p [# discussies] > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1 > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif -grootte 800 -hist 25> motif1.density OPMERKING: De findMotifsGenome.pl script Infers de verrijking van de vergelijking met willekeurig geselecteerde gen-centric achtergrond sequenties. De meest verrijkte roman motief wordt opgeslagen onder motif1.motif in het formaat van een positie gewicht matrix. De lezer wordt aangemoedigd om deze resultaten met andere de novo motief ontdekking methoden zoals cisFinder 22 en MEME 23 onderbouwen. Annoteren pieken door het berekenen van hun afstand tot de dichtstbijzijnde gen en door het bepalen van hun genormaliseerde read telling binnen 400 bp ramen (-grootte 400): > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -grootte 400 -d chip / Input /> ChIP_peaks.genes Vat de uitgang met behulp van de volgende awk commando naar de lijst van het aantal (N), de locatie en de genormaliseerde gelezen telling van individuele (R) en alle (LR) pieken per dichtstbijzijnde (doel) gen. > Awk 'BEGIN {FS =' t '} $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000 {N- [$ 8] + = 1; R [$ 8] + = $ 9; LR [$ 8] = LR [$ 8] ', &# 39; $ 7 '(' $ 9 ')'} END {voor (i in N) {Afdrukken i ' t' N [i] ' t' r [i] ' t' substr (LR [i], 2)}} 'ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary OPMERKING: Het aantal na $ verwijst naar het nummer van de kolom, die dienen modificeren om de ChIP_peaks.genes bestand gemaakt in de vorige stap past. Dit script voorbeeld filtert pieken dan 5 kb upstream en 1 kb stroomafwaarts van de TSS. $ 7, $ 8 en $ 9 hebben betrekking op de afstand tot de TSS, het gen-identificatie en de genormaliseerde gelezen telling per piek, respectievelijk. Voer de analyse van verrijkte GO termen verantwoordelijk doelgenen als volgt: Start de grafische gebruikersinterface van Blast2GO vanaf de commandoregel via Java Web Start (javaws) 19. > Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp Volg de instructies van de ontwikkelaars om de annotatie te uploadenbestand voor Xenopus genen (xenTro7.annot) zoals gegenereerd in 1.9.4 en een plat bestand van geïdentificeerde target genen. Zorg ervoor dat hetzelfde gen identifiers worden gebruikt in beide bestanden. Visualiseer chromatine profielen door het toevoegen van bobo (ChIP.bw, Input.bw) en BED-bestanden (ChIP_peaks.bed) in IGV als tracks. Aanvulling van gegevens met RNA-Seq tracks indien beschikbaar voor hetzelfde stadium van ontwikkeling. Resultaten als een sessie op te slaan. Gebruik het programmeren platforms R (www.r-project.org) of MATLAB verder te manipuleren en visualiseren van gegevens zoals hierboven gegenereerd. Als alternatief plot kleine datasets met Excel. 10. ChIP-qPCR for Testing chip en bevestigen ChIP-Seq Gebruik de on-line platform Primer3 om primers omliggende ongeveer 100 bp DNA-ontwerpen bij 60 ° C (T m) voor zowel positief (piek-specifiek) en negatieve controle loci. Bevestig primer specificiteit met behulp van de in silico </em> PCR zoekopdracht geïmplementeerd in de UCSC Genome Browser. Een 8-punts standaardcurve drie-voudige verdunningen beginnend vanaf ongeveer 1% input of gebruik de 2 – ΔΔC (T) 8,24 methode voor de kwantificering van DNA verrijking. Voeren real-time PCR in technische drievoud voor alle monsters, dat wil zeggen, spaander, controle en, indien nodig, standaard curve monsters. Plot DNA verrijking als percentage van de input DNA of als een verhouding van ChIP versus controle monster bij zowel positieve als negatieve controle loci.