Este estudio adaptado con éxito videofluoroscópico tragar estudio (VFSS) métodos humanos para su uso con modelos de enfermedad murinos con el fin de facilitar la investigación traslacional disfagia.
Este estudio adaptado videofluoroscópico humana tragar estudio métodos (VFSS) para su uso con modelos de enfermedad murinos con el fin de facilitar la investigación traslacional disfagia. Los resultados exitosos dependen de tres componentes fundamentales: cámaras de prueba que permiten la auto-alimentación mientras está de pie sin restricciones en un espacio confinado, recetas que enmascaran el sabor aversivo / olor de agentes de contraste orales disponibles en el mercado, y un protocolo de prueba paso a paso que permite la cuantificación de la fisiología golondrina. Eliminación de uno o más de estos componentes tendrá un impacto negativo en los resultados del estudio. Por otra parte, la capacidad de nivel de energía del sistema de fluoroscopia determinará que tragar parámetros puede ser investigado. La mayoría de los centros de investigación tienen fluoroscopios alta energía diseñados para su uso con las personas y los animales más grandes, lo que resulta en excepcionalmente pobre calidad de imagen cuando se prueban los ratones y otros roedores pequeños. A pesar de esta limitación, hemos identificado siete VFSParámetros S que son consistentemente cuantificable en ratones cuando se utiliza un fluoroscopio de alta energía, en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino. Hemos obtenido recientemente un sistema de fluoroscopia de baja energía con capacidades excepcionales de alta resolución de imagen y de ampliación que fue diseñado para su uso con ratones y otros roedores pequeños. Los trabajos preliminares con este nuevo sistema, en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino, ha identificado 13 parámetros golondrina que son consistentemente cuantificables en ratones, lo cual es casi el doble del número que se obtiene utilizando (es decir, de alta energía) convencional fluoroscopios. Se espera que la identificación de los parámetros de golondrina adicionales como optimizamos las capacidades de este nuevo sistema. Resultados hasta ahora demuestran la utilidad de usar un sistema de fluoroscopia de baja energía para detectar y cuantificar los cambios sutiles en la fisiología golondrina que de otro modo puede pasarse por alto cuando se utiliza fluoroscópios de alta energía para investigar modelos de enfermedad murinos.
La disfagia (deglución deterioro) es un síntoma común de numerosas condiciones médicas que afectan a personas de todas las edades. Los ejemplos incluyen accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, parálisis cerebral, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Batten, cáncer de cabeza y cuello, el nacimiento prematuro y el envejecimiento avanzado. La disfagia está altamente correlacionado con la mortalidad, por lo general como consecuencia de la desnutrición grave o neumonía que se desarrolla cuando-bacterial cargados de alimentos / líquido / saliva se aspira en los pulmones 1-4. Esta dolencia debilitante y potencialmente mortal afecta a más de 15 millones de personas cada año en los Estados Unidos solamente 3. A pesar de la alta prevalencia y los resultados negativos asociados, las opciones actuales de tratamiento para la disfagia se limitan a paliativos (en vez de curativo) enfoques, tales como modificación de la dieta (por ejemplo, evitar consistencias de alimentos / líquidos específicos), cambios posturales (por ejemplo, tucking de la barbilla al tragar), los enfoques de motor (por ejemplo, ejercicios que apuntan los músculos en la cavidad oral, la faringe y la laringe), los enfoques sensoriales (por ejemplo, el sabor de aplicación, temperatura, y / o la estimulación mecánica), y el tubo de alimentación (por ejemplo, nutrición e hidratación administrada vía nasogástrica (NG) sonda o gastrostomía endoscópica percutánea (PEG) de tubo). Estos tratamientos sólo sirven como tratamiento sintomático y no se abordan las causas subyacentes del problema. De hecho, una barrera importante para el descubrimiento de nuevos tratamientos eficaces, para la disfagia es el conocimiento científico limitado de los mecanismos patológicos responsables, que probablemente diferente para cada enfermedad.
La disfagia diagnóstico se realiza predominantemente mediante un procedimiento radiográfico llamado videofluoroscópico tragar estudio (VFSS), también conocido como un estudio de trago de bario modificado. En los últimos más de 30 años, esta prueba de diagnóstico ha sido considerado como el estándar de oro para evaluating función golondrina 5-7. Esta prueba implica que el paciente sentado o de pie dentro de la trayectoria del haz de rayos X de una máquina de fluoroscopia mientras voluntariamente la ingestión de alimentos y consistencias líquido mezclado con un agente de contraste oral, típicamente sulfato de bario 8,9 o iohexol 10. A medida que el paciente traga, los alimentos y líquidos que contienen agente de contraste se puede ver en tiempo real a través de un monitor de ordenador durante el viaje desde la boca hasta el estómago. Estructuras de los tejidos blandos también son visibles y pueden ser evaluados en relación a la estructura y función. Se les pide a los pacientes para llevar a cabo varios tragos de cada comida y consistencia líquida, todos los cuales son de vídeo grabado para su posterior visualización y análisis cuadro por cuadro para cuantificar la presencia y grado de disfagia. Numerosos componentes fisiológicos de la deglución son típicamente analizadas, como el punto de disparo anatómica de la deglución faríngea, bolo tiempo de tránsito a través de la faringe y el esófago, el alcance y la duración de Laryngeal elevación, la ubicación y cantidad de residuos post-deglución, y la aparición de y la razón fisiológica para la aspiración 7,11.
Aspectos del protocolo VFSS humana fueron adaptadas recientemente para el estudio de ratas libremente comportan; Sin embargo, los resultados fueron limitados debido a las ratas no se quedaron en el campo videofluoroscópico de vista durante la prueba 12. VFSS no ha sido previamente tratado con ratones. Éxito de la adaptación del protocolo VFSS humana para su uso con ratones y ratas proporcionaría un método de investigación novedosa para investigar los cientos de modelos de enfermedades que se sabe que causan disfagia en los seres humanos murino actualmente existente (ratón y rata). Este nuevo método (en adelante, VFSS murina) sería, por tanto, acelerar la identificación y validación de modelos murinos de disfagia que son adecuados para la investigación de los mecanismos neurofisiológicos subyacentes en el tejido músculos, los nervios y el cerebro que son patológicos y contribuyendo a la disfagia in seres humanos. Por otra parte, murino VFSS permitiría la identificación de medidas objetivas (biomarcadores) de la función golondrina / disfunción que pueda compararse directamente con los seres humanos. Estas especies cruzadas biomarcadores videofluoroscópicas podrían luego servir medidas de resultado como nuevos para cuantificar la eficacia del tratamiento en los ensayos preclínicos con ratones y ratas, que sería mejor traducir a los ensayos clínicos con personas.
Para este fin, el protocolo VFSS murino se estableció utilizando ~ 100 ratones de ambos sexos. Todos los ratones eran o C57 o híbridos cepas C57 / SJL. Los ratones C57 no fueron alterados genéticamente, mientras que C57 / SJL fue la cepa de fondo para una colonia de ratones transgénicos SOD1-G93A (o SOD1), el modelo animal más utilizado de la ELA. La colonia SOD1 fue un aproximado de 50-50 mezcla de transgénicos (es decir, los afectados por ELA) ratones y las camadas no transgénicas (es decir, no afectados).
El protocolo VFSS murino consta de tres componentes:
El efecto combinado produce un bajo estrés, ambiente cómodo, de autoalimentación examen que permite la evaluación de la alimentación típica y tragar comportamientos de los ratones.
Cientos de modelos murino (ratón y rata) están disponibles comercialmente para estudiar enfermedades humanas. Sin embargo, sólo tres modelos murinos de enfermedades se han investigado específicamente en relación con disfagia: un modelo de ratón de la ELA y la rata 13,14 modelos de la enfermedad de Parkinson 12,15-17 y accidente cerebrovascular 18. Cada uno de estos estudios preliminares utilizaron diferentes metodologías para evaluar la disfagia, lo que hace imposible deducir comparaciones significativas entre las especies y enfermedades. Esta importante limitación puede superarse en los estudios futuros utilizando el protocolo VFSS murino de nuevo desarrollo que permite la cuantificación objetiva de numerosos parámetros de golondrina en animales de auto-alimentación.
Resultados VFSS exitosas dependen de tres componentes fundamentales: 1) cámaras de prueba que permiten la auto-alimentación mientras está de pie sin restricciones en un espacio cerrado, 2) recetas que enmascaran el sabor aversivo / olor a la venta en tiendas ag contraste oralpadres, y 3) un protocolo de paso a paso de la prueba que permite la cuantificación de la fisiología golondrina. El efecto combinado produce un bajo estrés, ambiente cómodo, de autoalimentación examen que evoca la alimentación típica y comportamientos para tragar. Eliminación de uno o más de estos componentes tendrá un impacto negativo en los resultados del estudio. Ejemplos de resultados negativos incluyen la incapacidad para mantener los animales en el campo de la fluoroscopia de vista, comportamientos indeseables que lo distraigan de la bebida, la aversión al agente de contraste oral, y la imposibilidad de cuantificar parámetros golondrina debido a episodios de consumo insuficientes.
Un reto importante en la obtención de resultados óptimos VFSS estaba diseñando una cámara de prueba adecuado. Numerosas revisiones del diseño de nuestro prototipo culminaron en una cámara de observación que mantiene suficientemente ratones en el campo de visión y previene comportamientos que distraen de la bebida. Las cámaras se hicieron utilizando fresadoras para obtener dimensiones uniformes de los XXtubos y e-tapas de los extremos, garantizando así la intercambiabilidad de componentes para varias cámaras de observación del mismo diámetro. Las dimensiones interiores (diámetro y longitud) se emparejaron a ser ligeramente más grande que el tamaño del cuerpo de un ratón adulto, lo que resultó en una cámara de prueba suficientemente estrecho que permite caminar en línea recta y darse la vuelta. El diseño estrecho, en combinación con el posicionamiento estratégico de la boquilla y PEG-tazón sólo en el extremo, mantiene la cabeza y el cuerpo de los ratones alineados a lo largo de la longitud de la cámara, mientras que beber. Una vez enganchado en el agua potable, los ratones permanecen notablemente auto-estabilizado en la boquilla o recipiente durante varios segundos a la vez, lo que resulta en un mínimo de artefactos de movimiento para interferir con la prueba. Así, es posible obtener, la observación de cerca / grabación de vídeo sin distorsiones e imágenes videofluoroscópico de los ratones, mientras que beber en los planos laterales y dorsal-ventral.
Ratones (y otros roedores pequeños) son naturalmente inclinados a verk refugio en espacios pequeños. Como resultado, ellos libremente entran en la cámara de prueba (con un extremo ya cerrado por una tapa posterior) cuando se coloca en la jaula de alojamiento, eliminando así el estrés / ansiedad causado por la manipulación (es decir, recoger manualmente el animal para colocarlo en la cámara). Una vez que el ratón entra en la cámara, el otro extremo está cerrado por unir un tapón terminal 2 nd. Este diseño evita el escape mientras se crea una cámara de prueba de la ansiedad baja para los ratones para explorar libremente.
La forma cuadrada de la cámara proporciona incorporado en la estabilidad de movimiento que permite que sea utilizado de manera independiente, eliminando así la necesidad de pruebas dentro de una jaula de roedores estándar. Todo el aparato es ligero, portátil, apilable con fines de almacenamiento, resistentes, fáciles de limpiar, y puede esterilizarse en autoclave. Mientras que las cámaras fueron diseñadas inicialmente para su uso con fluoroscopia, también son compatibles con la radiografía lugar de película, de neuroimagen (por ejemplo, MRI, PET, CT), y visual observación / grabación de video de varios comportamientos.
Un segundo gran reto que superar fue enmascarar el sabor aversivo / olor de agentes de contraste por vía oral (es decir, sulfato de bario o iohexol). Teniendo en cuenta que la sensibilidad del gusto varía ampliamente entre las cepas de ratón 19-21 y tal vez con 22,23 años de edad, era necesario para identificar una solución de prueba individual que era aceptable para todos los ratones, independientemente de cepa y edad. Este resultado es esencial para permitir comparaciones directas de la función golondrina / disfunción través de las cepas y las edades, mientras que la eliminación de resultados de confusión debido a diferencias en reológico (por ejemplo, viscosidad, densidad, etc.) y las propiedades químicas de las soluciones de ensayo. Con este fin, hemos desarrollado un enfoque de detección simple, palatabilidad rápida para identificar el potenciador del sabor preferido para enmascarar el sabor aversivo / olor de agentes de contraste por vía oral durante VFSS murino. Métodos fueron modelados después de la breve prueba de exposición, lo que requiere una manoometer (es decir, sensor de lamer) para registrar las tasas de lamer durante los primeros 2 minutos después de un período de regulación del agua (es decir, agua durante la noche retención) para inducir la sed 24,25. A lickometer no estaba disponible para este estudio; Por lo tanto, la preferencia se evaluó mediante observaciones de comportamiento, así como los métodos de grabación de vídeo estándar para la tasa de lamer que han sido validado previamente en nuestro laboratorio de 13,14. El uso de este enfoque de detección palatabilidad, chocolate fue identificado como el potenciador del sabor preferido por cepas C57 y C57 / SJL. Específicamente, 100% de los ratones en cada jaula bebió fácilmente soluciones con sabor a chocolate dentro de 30 segundos de exposición, con múltiples ratones potable simultáneamente en el surtidor. Sin embargo, la adición de bario dio lugar a sólo borracheras breves por la mayoría de los ratones, independientemente de la concentración de bario o chocolate.
Una alternativa al bario es yohexol, un agente de contraste a base de yodo que sólo recientemente ha sido reconocido como un suitabla alternativa a sulfato de bario para VFSS humano 10; Por lo tanto, aún no se ha estandarizado para este propósito. Varias concentraciones diferentes de iohexol con sabor de chocolate se les ofreció a los ratones. Recetas que contienen hasta un 50% de solución de stock iohexol (350 mg de yodo por ml) se bebían fácilmente por la mayoría de los ratones después de un período de regulación del agua durante la noche. Las concentraciones más altas resultaron en conductas de evitación. Un yohexol 50% (350 mg de yodo por ml) produce suficiente radiodensidad mientras era devorado por los ratones, mientras que las concentraciones más bajas fueron marcadamente menos visible y obstaculizaron la cuantificación de la fisiología golondrina. Por lo tanto, la solución de prueba óptimo para VFSS con los ratones fue identificado como una solución iohexol 50% con sabor a chocolate añadió. Pruebas de palatabilidad Repita no dio lugar a conductas de evitación o eventos adversos.
Un tercer reto a superar impedía a los ratones de torneado / inclinando su cabeza mientras que beber, que oscurece la visualizacióndel mecanismo de la deglución durante VFSS. Beber de un tazón clavija posicionada justo por encima del suelo en un extremo de la cámara resuelve este problema. Hay varias ventajas adicionales de la utilización de un cuenco de PEG en vez de una botella de tubo para sorber. Por ejemplo, un volumen calibrado de líquido se puede verter en la PEG-tazón a través de un orificio de ventilación en el tapón terminal del tubo de observación. Este enfoque permite la cuantificación del volumen minuto de solución de ensayo consumida durante la breve duración de la prueba VFSS. Además, el aumento del área de superficie de la solución de prueba en el PEG-cuenco, en comparación con una pequeña abertura del tubo succionador, pueden proporcionar aumento de la estimulación olfativa para motivar a más de beber. PEG-cuencos pueden ser más adecuados para el estudio de ratones jóvenes o menores de deformación, como la altura tazón es una distancia normalizada del suelo. En contraste, las longitudes de tubo para sorber deben ajustarse para dar cabida a los ratones de tamaño diferente, lo que añade otra variable potencialmente de confusión a considerar. Además, el modo de ratónls de enfermedades neurológicas pueden tener dificultades para llegar a una botella tubo para sorber debido a alteraciones motoras de las extremidades, mientras que pueden llegar fácilmente a un tazón de palo. Los ratones con la lengua y / o disfunción de la mandíbula puede ser incapaz de presionar lo suficiente el balón en el pico para acceder al líquido; utilizando PEG-cuencos puede eliminar este factor de confusión. Por estas razones, el uso de PEG-cuencos sobre botellas de tubo para sorber es el método preferido de la prueba VFSS murino. Sin embargo, las cámaras de observación fueron diseñados para acomodar pitón para beber según sea necesario. Una advertencia importante a considerar es que las tasas de lamer se sabe que difieren entre pico y tazón potable 13,26. Por lo tanto, la opción de caño o peg-bol para VFSS debe ser coherente dentro y entre los experimentos.
Un cuarto desafío fue identificar parámetros golondrina cuantificables para los ratones que son comparables a los parámetros VFSS comúnmente utilizados en los estudios de investigación en humanos y la práctica clínica. Nuestros resultados preliminares mostraron que eltipo de sistema de fluoroscopia determina que tragan parámetros pueden ser investigados en ratones. La mayoría de los centros de investigación y los centros médicos tienen alta energía (75-95 kV, 1.5 mA) fluoroscopios diseñado para su uso con las personas y los animales más grandes, que dan lugar excepcionalmente pobre calidad de imagen cuando se prueban los ratones y otros animales pequeños. A modo de ejemplo, un estudio reciente utilizando un fluoroscopio de alta energía con ratas fue capaz de identificar sólo 4 parámetros cuantificables golondrina 12, y hemos sido capaces de identificar sólo 7 parámetros de tragar para los ratones en el presente estudio. Para superar esta limitación principal, que recientemente obtuvo un sistema de fluoroscopia de baja energía llamada El Labscope (Glenbrook Technologies). El sistema es un fluoroscopio en miniatura que genera un cono de haz continuo de rayos X con energías de fotones entre 15 y 40 kV y una corriente del tubo de pico de 0,2 mA (8 W potencia máxima). Los niveles de energía más bajos de este sistema están mejor atenuadas por el hueso delgado y el tejido blando de los ratones y por lo tanto proporcionan higheresolución de contraste de r (es decir, de alta energía) convencional fluoroscopios. El haz de rayos X de La Labscope se dirige a un intensificador de imagen 5 cm de diámetro, que es notablemente más pequeño que el 15 a 57 cm de diámetro intensificador de imagen de fluoroscopios convencionales. La distancia mínima de fuente a intensificador (SID) de El Labscope es ~ 6 cm (en contraste con ~ 30 cm para fluoroscopios convencionales), que proporciona una mayor capacidad de ampliación. Además, El Labscope utiliza tecnología patentada que amplía digitalmente la imagen hasta 40 veces en tiempo real, sin alterar el SID. El resultado es, en esencia, un microscopio de rayos X que puede ampliar y reducir en tiempo real de ver las pequeñas regiones de interés, como el mecanismo de la deglución de un ratón.
Una ventaja importante de este sistema de fluoroscopia de baja energía se mejora la seguridad radiológica. Además de los animales que recibieron dosis de radiación inferior con el Labscope, los investigadores utilizan el sistema están expuestos a significativamente less dispersión de radiación. La exposición a la radiación directamente en frente de la unidad en el panel de control es de 10,3 mR / hr. A una distancia de 1 m en frente de la unidad, la exposición se reduce a 580 μR / hr. La mayoría de los otros lugares de la habitación tienen una muy baja exposición por debajo de 10 μR / hr. A pesar de esta mejora, hemos tomado medidas adicionales para mejorar la seguridad radiológica. Por ejemplo, el blindaje de acrílico con plomo se ha añadido alrededor de La Labscope bloquear fotones dispersados de rayos X, lo que permite a los investigadores a realizar pruebas VFSS murino sin usar protección personal (por ejemplo, delantales de plomo, escudos de tiroides, y vasos). Además, el acrílico transparente permite la visualización del ratón desde la distancia. Además de la seguridad radiológica es proporcionada por una mesa elevadora de tijera motorizada, que se controla de forma remota por el investigador. Desde una distancia de hasta 3 m del fluoroscopio, los investigadores pueden utilizar el dispositivo de control remoto para ajustar la posición vertical y horizontal de la cámara de observación dentro del bea de rayos Xm. Como resultado, las regiones anatómicas de interés se pueden mantener dentro del campo de vista de fluoroscopia mientras el ratón se mueve libremente dentro de la cámara de observación. Aunque la plataforma de tijeras fue diseñado para su uso con el Labscope, también es compatible para su uso con fluoroscopios convencionales para mejorar la seguridad radiológica para los investigadores. Un paso final para mejorar la seguridad de radiación durante murino VFSS implica el uso de un sistema de entrega de la jeringa para líquidos. Este sistema incluye un pie 3-4 (o más, si es necesario) longitud de tubo de PE, que permite la entrega rápida y eficiente de los líquidos en el PEG-cuenco de una distancia. Este sistema de entrega de la jeringa para líquidos, en combinación con las cámaras de observación, también se puede utilizar con fluoroscópios convencionales.
El trabajo preliminar utilizando la Labscope, en combinación con el nuevo protocolo VFSS murino, demuestra una gran ventaja de los sistemas convencionales: el número de parámetros que se pueden tragar i cuantificado confiablementes casi se duplicó. Sin embargo, las estructuras de los tejidos blandos del mecanismo de la deglución (por ejemplo, lengua, velo del paladar, de la pared posterior de la faringe, y la epiglotis) de los ratones no son fácilmente visibles cuando se utilizan sistemas de fluoroscopia de baja o de alta energía. Por lo tanto, nos centramos en la cuantificación de las medidas de flujo de bolo en lugar de la biomecánica de la deglución. Estábamos predominantemente interesados en parámetros que podrían cuantificarse en base a unidades de tiempo, área, distancia, volumen, etc., en lugar de utilizar medidas de la escala tipo Likert. Numerosos parámetros de flujo de bolo cumplimiento de este requisito se han descrito en la literatura VFSS humano, tales como el tiempo de tránsito oral, 27-29, 27-33 faríngea tiempo de tránsito, y el tiempo de tránsito esofágico 34-36, por nombrar sólo unos pocos. Transporte bolo a través de la cavidad oral no era fácilmente visible en ratones, probablemente debido al pequeño tamaño de bolo durante potable espontánea. Sin embargo, hemos sido capaces de cuantificar de manera fiable la faringe y de tránsito esofágico veces, asícomo varias otras medidas relacionadas con el flujo y el aclaramiento de bolo. Se espera que la identificación de parámetros adicionales golondrina de traducción que optimizamos las capacidades de El Labscope.
Los resultados de este estudio mostraron que los ratones que toman varios lame rítmicos por golondrina durante potable espontánea, con cada pequeño secuencialmente bolo líquido que llena el espacio vallecular antes de desencadenar la golondrina faríngea. Este comportamiento, que es típico de los mamíferos que utilizan lamiendo como el principal medio de la ingestión de líquido 37 a 40, se asemeja al patrón rítmico succión-deglución de deglución infantil humano y todos los mamíferos infantiles en general. Infant fisiología tragar se caracteriza por varios rítmica succiones seguidas de una golondrina faríngea reflexiva, comúnmente descrito como el ciclo de succión-deglución 37,41-43. Por lo tanto, la lengua y la mandíbula movimientos rítmicos involucrados en las conductas lamiendo ingestiva de ratones pueden ser más comparable a ingestiva chupadores comportamientos de zumbidoun niños pequeños en lugar de beber la taza de los niños y adultos. Por ello, hemos estado cuantificando la razón de tasas y lamer-golondrina lamer de los ratones para comparaciones futuras con la relación de chupar tasa y succión-deglución de los bebés humanos. Tal vez la investigación VFSS murino proporcionará información sobre los trastornos de deglución de desarrollo.
Como con cualquier nuevo método de investigación, se han identificado las áreas de mejora. Por ejemplo, el protocolo VFSS murino fue desarrollado utilizando sólo las cepas C57 y C57 / SJL de ratón; todavía no ha sido probado con ratas. Tendrá que ser reducido en tamaño (diámetro y longitud) para acomodar el tamaño de cuerpo más grande de las ratas Las cámaras de observación. Además, se desconoce si iohexol con sabor de chocolate es adecuada como una solución de ensayo VFSS murino universal. Por lo tanto, las pruebas de mayor escala con múltiples cepas de ratones y ratas se justifica para este propósito. Además, el uso de bario como agente de contraste para murino VFSS no debe ser descartada. Ratones prefiere claramente la iohexol recetas más de bario; intentos sin embargo más rigurosos y sistemáticos en enmascarar el sabor aversivo / olor de bario pueden proporcionar alternativas sabrosas a yohexol. Futuros estudios que comparan los efectos del sulfato de bario y iohexol (así como otros medios de contraste orales potenciales) sobre la preferencia y gusto tragan fisiología en ratones y ratas que, sin duda, proporcionar información importante que es directamente relevante y traslacional para VFSS humano.
VFSS con seres humanos incluye varias consistencias de alimentos y líquidos, y disfagia es más evidente al tragar líquidos delgados, y los alimentos sólidos secos 44,45. Por consiguiente, el protocolo de VFSS murino se está ampliando para incluir consistencias adicionales que pueden facilitar la detección y cuantificación de la disfagia en modelos de enfermedad. También será necesario llevar a cabo pruebas de viscosidad de las recetas líquidas para VFSS murino con el fin de ajustar las viscosidades para que coincida con los utilizados durante VFSS humano. Abordar estos límiteciones facilitarán la identificación de biomarcadores VFSS traslación de disfagia que se pueden comparar directamente entre los ratones, ratas y seres humanos.
La utilidad de VFSS murino se puede mejorar significativamente mediante la implantación de marcadores radiopacos en las estructuras de los tejidos blandos del mecanismo de deglución que de otra manera no son visibles, permitiendo de este modo la investigación de la biomecánica de la deglución. Este enfoque ha sido utilizado con éxito durante muchos años para estudiar la biomecánica de la deglución en los cerdos infantiles, usando una variedad de clips de metal y alambres 37,42. Esperamos que el uso de marcadores similares, pero más pequeñas, en ratones permitiría cuantificación de varios parámetros de golondrina adicionales para la comparación con los mamíferos más grandes, incluyendo los seres humanos. Actualmente estamos desarrollando una metodología para implantar marcadores radiopacos en la lengua, paladar blando, faringe, laringe y esófago proximal de ratones para probar esta hipótesis.
La grabacion de videog velocidad de fotogramas del fluoroscopios Labscope y convencionales es limitado a 30 fotogramas por segundo (fps). Sin embargo, nuestros resultados preliminares mostraron que la totalidad de la fase faríngea de la deglución para ratones sanos se produce en menos de 66 ms (es decir, 2 frames), que es aproximadamente 10 veces más rápido que los humanos. Por lo tanto, la fase faríngea de la deglución en los ratones se produce tan rápidamente que los detalles no son apreciables con una cámara de 30 fps. Una mayor velocidad de cuadro (probablemente> 100 fps) será necesario visualizar suficiente y cuantificar los movimientos muy rápidos y complejos de la fase faríngea de la deglución en ratones y otros roedores. En conjunción con una mayor velocidad de cuadro, la incorporación de tecnología biplano para fluoroscopia 3D sin duda ampliaría el murino utilidad VFSS. Por lo tanto, las futuras consideraciones de diseño deben incluir una cámara de mayor velocidad de cuadro y capacidades de imagen biplanares.
Por último, bajas dosis de radiación se ha demostrado que causa esterilidad enratones hembra C57, resultando en niveles alterados de hormonas ováricas estimulado que pueden confundir los estudios de vida útil 46. Los resultados relativos específicamente a los efectos de la exposición a la radiación de baja dosis repetida asociado con las pruebas de VFSS aún no se han investigado en ratones, otros animales, o seres humanos. Sin embargo, la disfunción ovárica (no relacionada con la exposición a la radiación) en hembras humanas se ha relacionado con trastornos de motilidad gastrointestinal, y específicamente a la disfagia en algunos casos 47, que proporciona otra advertencia a considerar en el diseño de estudios futuros VFSS que incluyen hembras (animales y humanos ). La exclusión de las mujeres se debe evitar, ya que las diferencias de género significativas en la función golondrina se ha informado de personas y 48,49 serían importantes para detectar y caracterizar en modelos de enfermedades de los animales también. Por lo tanto, los resultados de los estudios longitudinales VFSS en ratones y ratas de ambos sexos tienen un enorme potencial de la traducción para los seres humanos en relación con dysphagia, así como a los riesgos de exposición a la radiación de baja dosis asociados con las pruebas VFSS de repetición.
The authors have nothing to disclose.
Damos las gracias amablemente miembros adicionales del Lab Palanca que contribuyeron a la recolección de datos (Andries Ferreira, Danarae Aleman, Alexis Mok, Kaitlin Flynn, Elizabeth Bearce, y Matan Kadosh) y revisión de manuscritos (Andries Ferreira, Rebecca Schneider, y Kate Robbins). También reconocemos Roderic Schlotzhauer y Edwin Honse de la tienda de máquina MU Física por su entrada para el diseño y la fabricación de los tubos de observación de roedores utilizados en este estudio. Estamos especialmente agradecidos de Malea Jan Kunkel (Radiología Supervisor en el Departamento de Medicina Veterinaria y Cirugía en la Universidad de Missouri – Facultad de Medicina Veterinaria) y Jan Ivey (Gerente del laboratorio de la catedral de Investigación Animal de la Universidad de Missouri – Escuela de Medicina) para demostrar paciencia y motivación constante, mientras que la operación de los fluoroscopios de alta energía como desarrollamos el protocolo VFSS murino. Fuentes de financiación para este estudio incluían NIH / NIDCD (TE palanca), NIH / NINDS (GK Pavlath), Otolaryngofondos de Cirugía de Cabeza y Cuello de puesta en marcha (TE palanca), Fondo MU PRIME (TE palanca), Mizzou Advantage (TE palanca), y el Centro de MU sobre Envejecimiento (TE palanca) – logía.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Polycarbonate tubing for observation chambers | McMaster-Carr | 3161T41 | Body of observation tubes, 2"X2" diameter, 0.080" thick wall |
Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 9115K71 | End-caps for observation tubes, 2"x12"x3/4" |
Polycarbonate sheet for observation chambers | McMaster-Carr | 8574K281 | Peg-bowls for observation tubes |
Silicone O-rings for end-caps of observation chambers | McMaster-Carr | 9396K108 | S1138 AS568-029, pack of 25 http://www.mcmaster.com/#o-rings/=t0wt5r |
Silicone stoppers for observation chambers | McMaster-Carr | 2903K22 | Package of 10 stoppers to plug the oval opening in the top of the observation chamber when using a peg-bowl http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3803/=t0y5at |
Centrifuge tubes for sipper tube bottles | Evergreen Scientific | 222-3530-G80 | 30 ml freestanding centrifuge tubes, with caps, sterile https://www.evergreensci.com/labware-catalog/tubes-and-vials/30-and-50-ml-centrifuge-tubes/ |
Silcone stoppers for sipper tube bottles | Saint-Gobain Performance Plastics | DX263031-10 | Number 31D, size: 26 mm bottom, 32 mm top, 30 mm high; 10 pack; http://www.labpure.com/en/Products.asp?ID=179&PageBrand=STOPPERS |
Stopper borers for sipper tube bottles | Thomas Scientific | 3276G40 | Cork Borer Set that ranges from 3/16-15/16 inch http://www.thomassci.com/Supplies/Corks/_/CORK-BORER-SET-316-1516-IN?q=Humboldt |
Drinking tubes for sipper tube bottles | Ancare | TD-100 | 2 1/2” long drinking tubes with 5/16” opening, straight ball-spout http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point |
Iohexol for making oral contrast agent solution | GE Healthcare | 350 mg iodine per ml http://www3.gehealthcare.com/en/products/categories/contrast_media/omnipaque |
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Chocolate syrup for flavoring oral contrast agent | Herseys | ||
10 ml syringe for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 309604 | Luer lock tip syringe without needle, 100 per box http://www.bd.com/hypodermic/products/syringeswithoutneedles.asp |
Catheter tubing for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427451 | Polyethylene Tubing (Non-Sterile) (PE 240) 100' http://www.bd.com/ds/productCenter/427451.asp |
Needle for syringe delivery system | Becton, Dickinson and Company | 427560 | 15-gauge needle, fits into PE 240 catheter tubing http://www.bd.com/ds/productCenter/427560.asp |
Delrin acetal resin rod for syringe delivery system | McMaster-Carr | 8576K15 | 1/2 inch diameter, black http://www.mcmaster.com/#catalog/120/3609/=t0wvaf |
Acrylic sheeting for scissor lift | Ponoko | Laser cut http://www.ponoko.com |
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3D printed ABS frame | Engineering Rapid Prototyping Facility, University of Missouri | ||
Brass rods for scissor lift | Amazon | TTRB-03-12-03 | made into axles http://www.amazon.com/Brass-Seamless-Round-Tubing-Length/dp/B000FN898M |
Drawer slide for scissor lift | Richelieu | 10292G116 | Attaches to base of scissor lift http://www.lowes.com/pd_380986-93052-T35072G16_0__?productId=50041754 |
28BYJ-48 stepper motor for scissor lift | 2 each | ||
ULN2003 Darlington transistor array for scissor lift | Toshiba | ULN2003APG | Used as stepper drivers (2 each) |
ATTINY85 microcontroller for scissor lift | Atmel | ATTINY85-20PU | 2 each http://www.taydaelectronics.com/attiny85-attiny85-20pu-8-bit-20mhz-microcontroller-ic.html |
Nylon spur gear | McMaster-Carr | 57655K34 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k34/=t0yaqz |
Nylon spur gear rack | McMaster-Carr | 57655K62 | 2 each http://www.mcmaster.com/#57655k62/=t0ybh9 |
4-40 nylon machine screws | McMaster-Carr | 95133A315 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#95133a315/=t0yd8q |
4-40 nylon hex nuts | McMaster-Carr | 94812A200 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#94812a200/=t0ye29 |
Buna-N O-Ring AS568A Dash No. 104 | McMaster-Carr | 9452K318 | Lift assembly http://www.mcmaster.com/#9452k318/=t0yem7 |