Оценка Selective мРНК перевода в клетках млекопитающих по полисом профилирования
Özet
The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.
Abstract
Регулирование синтеза белка представляет собой ключевой точкой управления в клеточный ответ на стресс. В частности, регуляторные элементы осторожным РНК было показано, что позволит селективного перевода специфических мРНК, которые, как правило, кодируют белки, необходимые для конкретной реакции на стресс. Выявление этих мРНК, так и характеристики регуляторных механизмов, ответственных за селективного перевода был в авангарде молекулярной биологии в течение некоторого времени. Полисом профилирование является краеугольным метод в этих исследованиях. Цель полисом профилирования является захват трансляции мРНК путем иммобилизации активно перевод рибосомы на различных транскриптов и отделить полученные с помощью ультрацентрифугирования полирибосомы на градиенте сахарозы, что позволяет обеспечить различие между высоко переведенных транскриптов и плохо переведенных из них. Они могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью традиционных биохимических и молекулярных методов биологии. Важно отметить, что объединение рolysome профилирование с высокой пропускной геномных подходов позволяет крупномасштабного анализа поступательного регулирования.
Introduction
Регулирование синтеза белка (трансляция) является одним из ключевых клеточный процесс, который тесно связан с клеточной выживаемости. Учитывая, что перевод потребляет более 50% энергии клетки, это не удивительно, что перевод жестко регулируется и что возмущения в переводе не хорошо переносится. И наоборот, многие аномальные клеточные процессы требуют, чтобы перевод Приборы и выход перевод (т.е. протеом) должны быть изменены. Это часто бывает в различных реакция на стресс и болезненных состояний, и, вероятно, лучше всего иллюстрируется в рак. Ключевым преимуществом поступательного контроля является способность клеток к быстро перепрограммировать выход белка в ответ на различные внешние и внутренние триггеры, тем самым прекрасно механизм настройки, который склоняет чашу весов между выживания и гибели клеток 1.
Два аспекта поступательного контроля особенно интересны; понимание природы нормативной тесhanism (ы) и контрольные элементы, которые позволяют для конкретного перевода, а также определение специфических мРНК и их белковых продуктов, которые участвуют в клеточном ответе на конкретном триггера, вызвавшей селективного перевода в первую очередь. Полисом профилирование является метод, который позволяет эффективно изучение обоих процессов.
Общая цель технике полисом профилирования является изучение и количественную оценку перевода состояние специфических мРНК в различных клеточных условиях. Принцип метода заключается в захвате перевод мРНК путем '' замораживания '' активно перевод рибосомы на различных транскриптов и отделить получившиеся полирибосомы ультрацентрифугированием на градиенте сахарозы, что позволяет проводить различие между высоко переведенных транскриптов (связанного несколько рибосом) и плохо переведены те (обязательность одного или двух рибосом). В данном конкретном протоколе, циклогексимид антибиотик, который связывается с60S субъединицы рибосомы и блокирует высвобождение деацетилированного тРНК из рибосомы E сайта 2, применяется для подавления рибосом перемещение и тормозить рибосомы на переводе мРНК. Тем не менее, другие блокирующие агенты, такие как эметина, что перевод также блокирует удлинение 3, могут быть использованы.
В отличие от западной блоттинга и 35 S-метионина методов маркировки, которые измеряют конечный результат процесса перевода, полисом профилирование имеет преимущество измерения рибосомы ассоциацию с активно-переводных мРНК, что позволяет более детального изучения механизмов перевода в различных условиях. Следовательно, способ может быть легко адаптирован к специально изучать различные режимы перевода 4-6, белки факторов, участвующих в регуляции перевода 7-9 стрессовых условиях, влияющих на белковый синтез 1,10,11 или эффекты мРНК структур, таких как IRES или вверх по течению открытые рамки считывания на белковой синтезаторетезы 12-14. В настоящее время, полисом профилирования приложения, даже шире, с использованием ДНК-микрочипов 15 или следующего поколения секвенирования 16,17 анализа полисом-связанные мРНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysomal профилирование является мощным средством, что позволяет для количественной оценки состояния перевода специфических транскриптов в различных условиях лечения. Это очень простая техника, в принципе, все же это требует нескольких шагов исполнения, некоторые из которых имеют решающее значение для получения хороших профилей полисом. Эти ключевые шаги: 1) с помощью РНКазы химических веществ и Пластик, 2) подготовка хороших сахарозы градиенты (в нашем опыте 10-50% сахарозы градиенты работают лучше всего для эффективного решения 40 / 60S субъединицы и мРНК с связанных рибосом), и 3 ) с использованием клеток, которые экспоненциально растущих и не более 80% сливной для того, чтобы захватить самые высокие темпы перевода. Этот последний шаг должны быть приняты во внимание при выполнении процедуры, длинные клеток, таких как ген нокдауна или сверхэкспрессии, так что количество клеток к пластине будет функцией от того, сколько клетки будут сливающийся в конечной точке.
В результатах изложеТед здесь, полисом анализ профиля является важным инструментом для оценки Pdcd4 роль в регуляции трансляции из МРСЭ-укрывательстве мРНК XIAP и Bcl-XL 12. Тот факт, что мы не наблюдали каких-либо изменений в общих профилей полисом на Pdcd4 бросовым (рис 1В) позволил нам сделать вывод, что Pdcd4 не нарушить глобальную сотовую перевод в условиях эксперимента. Мы рядом используется анализ RT-КПЦР определить распределение XIAP и Bcl-XL мРНК в клетках, обработанных Pdcd4 или контроля миРНК. КПЦР является методом выбора для анализа профилей полисом, в отличие от стандартного RT-PCR или нозерн-блоттинга, потому что это дает возможность количественной, а не полуколичественного анализа распределения мРНК и для обнаружения тонких сдвигов в эффективности между трансляционной обработок. Используя эту технику, мы смогли показать, что распределение XIAP и Bcl-XL мРНК (выражено в виде процента от общего мРНК-мишени через грadient) был значительно смещен в тяжелых полирибосом (мРНК с большим количеством рибосом, связанных с ними) после Pdcd4 нокдауна (рис 1D, E), что свидетельствует об увеличении перевода этих мРНК. Это было далее подтверждено увеличением XIAP и Bcl-XL уровней белка, но не в их стационарных уровней РНК (рис 1F, G). Важно отметить, что распределение полисом от не-IRES варианта XIAP был неизменным между обработанной и необработанной клеток (рис 1в). В качестве альтернативы, поступательное эффективность может быть представлен как отношение содержания мРНК в полисом (обычно фракций от 5 до 10) по сравнению с monosomes (обычно фракций от 2 до 4) 14.
Использование элементов управления на протяжении протокола важно при проверке любой полисом профилирования результат, как пики, наблюдаемые из значений оптической плотности при 254 нм не могут самостоятельно отнести к рибосомной РНК (моющего средстваы, такие как Triton X-100 сильно поглощают в этой области спектра и может скрывать 40 / 60S пики в верхней части градиента). Пустые градиенты без лизата и / или лизата с буфером должны быть запущены, чтобы определить относительный вклад буферов к поглощению при 254 нм. Артефактного высшие структуры порядка могут также привести к ошибочным интерпретациям полисом, где есть фактически ни (например, "псевдо-полисом" 20). Секвестрации магний (используется в течение всей процедуры, чтобы стабилизировать 80S рибосомы) с двухвалентным катионом хелатора ЭДТК добавлен в лизатах и в буфер градиент (20 мМ в течение 15 мин) будет вызывать разделение рибосомы на составные малых (40S) и большие (60S ) подразделения. Таким образом, если пики абсорбции, записанные на 260 нм, действительно полисом, лечение ЭДТА разрушится профиль таким образом, чтобы один максимум будет наблюдаться в верхней части градиента, который соответствует освободить мРНК и рибосомных единиц (данные не показаны). Совпадающийс ЭДТА-индуцированной распада профиль, все конкретные цели, проанализированных кПЦР теперь должны быть найдены в верхней части градиента.
Число рибосом, связанных с мРНК не всегда является показателем того, насколько эффективно, что особенно мРНК переводится. В самом деле, есть определенные условия, в которых активное перевод на полисом становится застопорились 21,22 котором читатель должен быть в курсе. Определение или нет стенограммы активно занимаются с переводом оборудования может быть сделано путем) обработки образца с пуромицином, который в отличие от ЭДТА, вызывает «стоки» рибосом, которые активно транслокации через мРНК, или б) обработки образца с homoharringtonine который ингибирует транслокацию только первый рибосомы на стартовый кодон, снова вызывая «стоки» о любых последующих транслокации рибосомы.
Использование контрольных транскриптов для анализа КПЦР также имеет важное значение. Selecции транскриптов, которые не зависят от различных условий обработки, таких как некоторых генов домашнего хозяйства (GAPDH, актин, тубулин, нуклеолина), рибосомных мРНК (18S, RPL13A) или в данном случае не-IRES варианте XIAP IRES, играет важную роль в проверки, если эффект лечения на перевод специфичен или обобщить. Эти контрольные транскрипты можно использовать для нормализации распределение анализируемых мРНК, как было сделано здесь (XIAP и Bcl-XL мРНК были нормализованы к GAPDH мРНК и выражали как процент от общего содержания мРНК, представленной на сумму содержания мРНК в каждой фракции ) или, альтернативно, целевые и контрольные мРНК может быть выражена как абсолютных значений и показаны отдельно. КПЦР анализ входных лизатов (обычно 10% от общего объема) является еще одним шагом, который будет контролировать для распределения специфических мРНК. В идеале, содержание мРНК транскрипта определенного во входном лизата должна быть сопоставима с суммой содержания мРНК во всех проанализированных 10 фракций. В конце концов, Необязательный шаг для контроля фенола: шаг хлороформом является шип каждый полисом фракции с в пробирке транскрипции репортера мРНК (например, CAT, хлорамфеникол ацетилтрансферазу), которые будут впоследствии количественно кПЦР и даже может быть использован для нормализации Данные 14.
Как и в любой технике, полисом профилирование представляет некоторые ограничения. Тот факт, что, как правило, не менее 10 фракций (более тонкие изменения в эффективности перевода может потребоваться 20 или более) должны быть собраны, чтобы иметь хорошие дистрибутивы полисом делает этот шаг ограничения, в том смысле, что только максимум 4 образцов может быть проанализированы в то время, чтобы иметь возможность удобно обрабатывать экстракции РНК и КПЦР анализ 40 образцов и 4 управления вводом сразу. Размер выборки можно легко добавить с сколько стенограммы должны быть проанализированы и сколько КПЦР повторяет сделать, и это может быть дорогостоящим. Другим ограничением в КПЦР основе polysomal профилированиянализ в том, что это может быть сделано только на кандидата на основе подхода (где транскрипты, которые будут проанализированы, как известно заранее) и не может быть применен для генома анализа перевода. Тем не менее, в начале 21-го века, исследователи начали допрашивать их polysomal РНК в геномной уровне с использованием ДНК-микрочипов 15 и совсем недавно с следующего поколения секвенирования 16,17. В этой мощной подхода, polysomal профилирование выполняется, как описано в данном протоколе исключением того, что вместо выполнения КПЦР анализ отдельных фракций, monosomes фракций (как правило, фракция 2-4) и полисом фракций (обычно фракции) объединяются вместе и вариации в глобальном переводе проанализированы по ДНК микрочипов или целого генома РНК последовательности. Поэтому при таком подходе, можно оценить все мРНК, распределение сдвигов от полисом для monosomes (уменьшение в переводе) или наоборот (увеличение в переводе) на определенном удовольствияния. Проверка и количественное определение конкретного распределения мРНК полисом может быть сделано путем кПЦР. Еще более мощным использование принципа polysomal профилирования является рибосома профилирование. Дальнейшее расширение высокая пропускная этой техники недавно сообщалось, что позволяет для одновременного наблюдения сотен полисом фракций 23. Это обеспечивает явное преимущество при зондировании поступательные КПД мутантных коллекций или в крупных экранов РНК-интерференции. Рибосомы профилирование является метод, который использует преимущества следующего поколения последовательности на карту фрагменты РНК, защищенные рибосом (рибосом следы), участвующих в синтезе белков 24,25. В этой технике, рибосома транслокации может быть подавлено с циклогексимидом (обратимой) или эметина (необратимой) с последующим лизисом клеток и гидролиза РНКазой с получением популяции рибосом следов. Рибосомы обогащены, общая РНК выделяют, и загрязнение рибосомальная и митохондриальная рибосомальной РНК удаляется.РНК следы примерно 26-28 нуклеотидов изолированы, обратной транскрипции, превращается в библиотеке кДНК и последовательность 26. В отличие от стандартного полисом профилирования, этот подход не только определяет конкретные мРНК, которые поступательно регулируется, но также дает мРНК-конкретную информацию при разрешении кодонов, такие как точное оккупации и плотности рибосом вдоль определенного транскрипта. Это особенно интересно для мРНК с конкретными видами перевода, таких как IRES-укрывательстве мРНК, так как это может дать больше информации о том, где на стенограмме рибосомы вербовки происходит.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gradient Master 108 automated gradient maker | BIOCOMP | 107-201M | |
| Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker | LABCONCO | 4517000 | |
| Beckman Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Model # L-100-XP | |
| Density gradient fractionator | TELEDYNE ISCO | 69-3873-246 | Composed of: tube piercing system, peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector |
| WinDaq data acquisition software | DATAQ INSTRUMENTS | WINDAQ/LITE | http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm |
| Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14×89 mm) | Beckman Coulter | 331372 | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose) | DiaMed | PRE1900-N | |
| Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom) | SafeSeal | 12000 | |
| Sucrose (nucleases-free) | Calbiochem | 573113 | MW = 342.3 g/mol |
| Cycloheximide | SIGMA | C7698 | MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing. |
| Sodium chloride (nucleases-free) | OmniPur | 7710 | MW = 58.44 g/mol |
| MgCl2.6H2O (nucleases-free) | OmniPur | 5980 | MW = 203.3 g/mol |
| Tris Base (nucleases-free) | J.T. Baker | 4109-01 | MW = 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | OmniPur | 9400 | Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation |
| Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2515 | |
| RNaseZap Rnase inactivation solution | Ambion, Life Technologies | AM9780 | |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen, Life Technologies | AM9516 | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Ambion, Life Technologies | AM9722 | Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion |
Referanslar
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
- Tscherne, J. S., Pestka, S. Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells. Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).
- Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. Translational coregulation of 5’TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR. Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- McKinney, C., et al. Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication. Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).
- Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast. Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).
- Gross, J. D., et al. Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E. Cell. 115 (6), 739-750 (2003).
- Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response. Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).
- Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate. Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Occhi, G., et al. A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype. PLoS Genet. 9 (3), (2013).
- Faye, M. D., et al. Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon. Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).
- Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biol. 14 (11), (2013).
- Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).
- Corbin, F., et al. The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes. Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).
- Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. Distinct 5′ UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress. Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).
- Thermann, R., Hentze, M. W. Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Graber, T. E., et al. Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).
- Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. High-throughput polyribosome fractionation. Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
