Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

참고 : 참고를 RNA 작업에 : RNases에 의해 RNA 저하를 방지하기 위해 표준과 같은 예방 조치를 취하십시오. 프로토콜의 모든 단계에서 장갑, 장벽 피펫 팁의 RNase없는 plasticware에 화학 물질을 사용합니다. 모든 솔루션을위한 초순수 또는 DEPC 처리 된 물을 사용하십시오. 제조 업체의 프로토콜 다음의 RNase 비활성화 솔루션으로 의심되는 표면의 오염을 제거. 솔루션 1. 준비. 염기성 용액 500 ml를 준비한다. (0.3 M의 NaCl, 15mM의의 MgCl 2 6H 2 O 15 mM 트리스 -HCl, pH 7.4). 솔루션이 깨끗해질 때까지 교반 막대를 사용하여 혼합하고 0.45 μm의 필터를 통과. 실온에서 보관하십시오. 다음과 같이 10 및 50 % 자당 솔루션 및 60 % 체이스 솔루션을 준비 : 10 % 자당 솔루션, (V / W) 50 ㎖ 원심 분리 관에 5g의 크로스를 추가하고 기본 솔루션으로 50ml로 채운다. 50 ㎖ 원심 분리 튜브 광고 중 50 % 수 크로스 용액 (/ w v)의 내용D 25g 자당과 염기성 용액에 50ml로 채운다. 60 % (W / V) 추적 솔루션, 50ml의 원심 분리 관에 30g의 설탕을 추가하고 기본 솔루션으로 50ml로 채운다. 포화 브롬 페놀 블루 용액 100 μl를 추가 (용해되지 더 때까지 물에 브로 모 페놀 블루를 추가, 원심 분리기가 용해되지 않은 분말 펠렛) 60 % 추적 솔루션을. 소용돌이를 사용하여 혼합하고 완전한 용해를 확인합니다. 4 ° C에서 보관 솔루션은 필요할 때까지. RNA 용해 버퍼를 준비합니다. 실험 당일 신선한 버퍼를 준비합니다. 각 샘플에 대해 RNA 용해 버퍼의 500 μl를 준비합니다. 1 염기성 용액의 ㎖를 추가 10 μL 트리톤 X-100 (1 % [의 V / V] 최종), 100 ㎎ / ㎖ 사이클로 헥시 미드 DMSO에 (CHX, 0.1 ㎎ / mL 최종) 3.5 μL의 RNasin 1 μL (140 U / ㎖). 소용돌이를 사용하여 섞는다. 얼음에 보관하십시오. 참고 : 사이클로 헥시 미드 높은 독성과 돌연변이의 원인이 될 수 있습니다. 피부 접촉과 흡입을 피할 것. 너무 자주 분말 형태로 처리를 방지하기 위해, 준비DMSO, 나누어지는 100 ㎎ / ㎖ 주식의 더 큰 수량은 장기 저장을 위해 -80 ° C에 보관하십시오. -20 ° C에서 주식을 계속 작업. 실험 날, 원하는 10 %의 체적 50 % 수 크로스 용액 (구배 당 각 용액 ~ 7 ㎖)에 CHX (0.1 ㎎ / ㎖의 최종 농도)을 첨가하여 자당 + CHX 솔루션을 준비. 자동 그라데이션 메이커를 사용하여 자당 기울기 2. 준비 그라데이션 메이커 ''ON ''를 켜고 그라디언트 보유 할 판 레벨 (criticalstep!)를 클릭한다 ''완료 ''판은 수평됩니다. 메뉴에서 그라데이션 프로그램을 선택 실행합니다 : 를 눌러 ''GRAD ''메뉴 ''LIST ''를 선택합니다. "SW41"를 선택합니다. 목록을 스크롤하고 선택을 눌러의 '프로그램''10 – 11 단계 – 50 %의 기울기를 ''런 (RUN)'버튼을 보내고. 마커 블록에 원추형 초원 심 분리기 튜브 (SW-41 관, 14 X 89mm)를 놓고 마커 블록의 상위 단계를 따라 튜브에 표시를 추적하기 위해 제공 미세 튜브 마커를 사용합니다. 안정된 표면에 피팅 랙에 튜브를 놓습니다. 참고 :이 표시는 10, 50 % 자당 솔루션을 레이어드 충전 가이드가 될 것입니다. 2 개의 10 ml의 주사기에 제공된 두 개의 정맥을 연결하고 RNA 분해 효소 불 활성화 솔루션을 포함하는 따뜻한 증류수와 피펫 팅에 의해 아래로 씻는다. 이후 물의 모든 흔적을 제거해야합니다. 10 % 자당 +의 CHX와 주사기 중 하나를 입력하고 초원 심 분리기 튜브의 바닥에 캐 뉼러를 삽입합니다. 그냥 튜브에 만든 마크 과거가 될 때까지 조심스럽게 10 % 자당 솔루션을 분배. 참고 : 거품을 피합니다. 거품이 형성되면, 조심스럽게 그들을 대체하기 위해 튜브를 누릅니다. 50 % 자당 + CHX와 다른 주사기를 끄기, 여분의 액체를 닦아초원 심 분리기 튜브의 하단에 삽입 부드럽게 닦아 정맥으로. 정확히 마크에 도달 할 때까지 조심스럽게 50 % 자당 솔루션을 분배. 신속하고 원활하게 정맥을 제거합니다. 참고 : 10 % 자당이 튜브에 상승 상단에 메 니스 커스 (meniscus)를 형성한다. 그렇지 않은 경우, 표면에서보다 10 % 수 크로스 용액을 첨가. 약간 초원 심 분리기 튜브를 기울 모든 공기 방울을 변위에 의해 제공된 캡을 삽입합니다. 마이크로 피펫과 캡의 저수지에서 물기를 제거합니다. 그라데이션 메이커 접시에 튜브 벽과 장소에 따라 물기를 닦아주십시오. '런 (RUN)'버튼을 누릅니다. 참고 : 플레이트는 그라데이션이 시작 형성하기 위해 5 초와 회전에 대한 일시 정지, 지정된 각도로 기울일 것입니다. 그라데이션 형성 (약 2 분, 기계가 비프 음)이 완료되면, 부드럽게 랙에 초 원심 분리기 (들), 장소를 제거하고 신속하게 gradie을 방해하지 않도록 상향 이동에 캡을 제거NT. 얼음에 그라데이션 (들)을 유지합니다. 방해하지 마! 또한, 그라디언트는 4 ℃에서 하룻밤 유지. 또는 다음과 같이 그라디언트를 만들기 위해 두 개의 챔버 그라데이션 메이커를 사용 : RNA 분해 효소 불 활성화 솔루션과의 RNase 무료 물로 씻어 튜브 및 그라데이션 메이커. 그라데이션 메이커의 근위 실에 50 % 자당 + CHX 5 mL를 추가하고 두 개의 챔버 사이에 공기가 제거되어 있는지 확인합니다. 그라데이션 업체의 말단 챔버에 10 % 자당 + CHX의 5 ML을 추가합니다. 튜브 홀더에 원추형 원심 분리기 튜브의 바닥 (SW-41 관, 14 X 89mm)과 장소에 50 % 자당 + CHX의 0.5 ML을 추가합니다. "3"(약 1 ㎖ / 분)으로 설정 속도로 인접 실에 배치 교반기, 오픈 스톱 (Stop) – 자지 및 예금 그라데이션을 켭니다. 얼음에 장소 구배 (들). 방해하지 마십시오. 참고 : 그라디언트는 4 ℃에서 하룻밤 유지 될 수있다. 3. 세포 용해 및 초 원심. <ol style="여백 왼쪽 : 40px;"> 4 ℃에 SW-41 로터와 4 ° C에서 버킷 설정 원심 분리기를 놓습니다. NOTE : 세포 용해 과정이 두 개의 150mm의 subconfluent (~ 70-80% 합류) 경사 당 HEK293 세포 플레이트에 최적화되고 사용 볼륨이 상이한 세포주에 대해 조정될 필요가있다. 최소 24 시간 이전에 용해에 성장 미디어에서 적절한 세포 밀도에서 플레이트 세포. 0.1 ㎎ / ㎖의 CHX을 함유하는 성장 배지의 분취 량 (150mm 플레이트 당 20 ml)로 준비한다. 체포 polysomes을 안정시키기 위해 37 ° C / 5 % CO 2에서 3 분 (150mm 플레이트 당 20 ㎖) CHX + 미디어의 세포를 품어. 얼음 접시, 장소 플레이트에서 빠르게 대기음 미디어 작업과 10 ml의 얼음 차가운 인산 완충 식염수로 한 번 세포를 씻으 (PBS는 137 mM의 NaCl을 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4) 보충 SID 아래로 천천히 피펫 CHX (0.1 ㎎ / ㎖의 최종 농도) 조심와접시 벽의 E는 세포 단일 층의 리프팅을 최소화합니다. 기음 PBS 각 플레이트에 추가로 10 ml의 PBS + CHX 추가는 셀 리프터 세포를 긁어 얼음에 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 두 플레이트에서 총 부피를 전송. 다운 스트림 단백질 분석을위한 얼음에 미세 원심 튜브에 세포 현탁액 1 ㎖를 보관하십시오. 원심 분리기 10 분 동안 4 ° C에서 300 XG에 세포의 50 ML 튜브. 차가운 얼음 RNA 용해 버퍼 500 μL의 모든 PBS 및 재현 탁 펠렛을 제거합니다. 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 피펫 위를 Lyse 세포에 아래로 가끔 소용돌이로 교반과 함께 10 분 동안 얼음에 품어. 5 분 핵 펠렛 4 ° C에서 2,000 XG에 원심 분리기. 새로운 2 ㎖의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 17,000 XG에 원심 분리기 세포 파편을 펠렛. 새로운 2 ㎖의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 측정하기 위해 2 μL를 사용260 nm에서 광학 밀도 (빈 사용 용해 버퍼). 총 RNA의 분석을 위해 각 샘플에서 50 μL (전체의 10 %)를 제거합니다. 필요할 때까지 해물이 -80 ° C에 저장 될 수 있습니다. (; 필요한 경우 추가 용해 버퍼에 집중 해물을 희석. 500 μL의 최대 볼륨, OD (25) 최적의 분 10 OD)을 조심스럽게 각각 자당 그라디언트에 동일한 A260 단위를로드합니다. 확인 그라디언트 서로 이전에 초 원심 0.1 g에 있습니다. 4 ℃에서 1.5 시간 동안 39,000 RPM (260,343 XG)에서 원심 분리기 그라디언트를 사용합니다. 스핀 다운시에 로터 브레이크를 유지하고 1000 RPM에 도달 할 때 감속하는 동안 전원을 끄십시오. 참고 :이 단계는 브러시 헤드는 제동시 로터에 문의로 가속의 급격한 변화로 인한 그라디언트의 방해를 최소화 할 수 있습니다. 4. 그라데이션 분별 시스템 장비 셋업. 설정 악기와 빈들다음과 같이 물을 pectrophotometer : 구성 요소의 전원을 켜고 램프가 워밍업하기 위해 적어도 15 분 동안 할 수 있습니다. 확인 부분 수집기는 'polysom​​e'방법으로 설정 (2 회를 눌러 폴더 아이콘, 반환은 홈 화면으로 돌아가 두 번 화살표). 소수 컬렉터에 밸브를 확인하는 (휴지통 아이콘을 가리키는 화살표)를 낭비하도록 설정되어 있습니다. 폐기물 수집 관에서 증류수가 들어있는 250ml의 삼각 플라스크를 놓습니다. 차트 레코더에서 다음 설정을 선택합니다 설정 감도는 'SET 램프와 광학'에 전화; '1.5'에 노이즈 필터 스위치를 설정; 'OFF'로 피크 분리 다이얼을 설정; '30의 CM / 시간 '에 (5cm / 10 분) 차트 단축 다이얼을 설정; 기준은 '최대 오픈'에 (분광 장치의 상단에) 다이얼을 조정 설정합니다. 참고 : 선택 사항 : 디지털 레코더 소프트웨어 대신 차트 레코더 사용할 수 있습니다. 컴퓨터에서 '시작'을 클릭합니다. 인수 창이 열립니다 : 일에서E 옵션 메뉴의 선택을 해제 일시 정지 그래픽. 스케일링에서 (실행 중에 온 – 더 – 플라이 변경 될 수 있습니다) -10과 100 그래프의 한계를 설정합니다. 새 파일을 생성하고 실행을 기록하기 위해 저장 버튼을 클릭합니다. 펌프에 주사기 배럴을 놓고 장소 (사용 제공된 나사와 육각 렌치)로 조입니다. 참고 : 너무 세게 조이지 마십시오. RAPID 속도로 ''REV ''명령을 사용하여 추적 솔루션과 주사기를 입력합니다. 수직 위치에 펌프를 놓고 'FORWARD' '명령을 사용하여 튜브를 통해 공기를 쫓아. 단이 기능 및 세척을 위해 RAPID를 사용합니다. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 가득 초원 심 분리기 튜브를 설치합니다. 피어스는 두 개의 검은 색 마크까지 캐 뉼러와 초원 심 분리기 튜브 볼 수 있습니다 (분배 구멍이 두 표시 사이 위치) 및 6.0 ml / 분에서 '' '매뉴얼'에 주사기 펌프를 시작합니다. 물 (C 때 플로우 셀을 통과 할하세 솔루션은 변수에) 스위치 속도를 튜브의 1/3을 채우고 1.0 ml / 분으로 설정. 1.0 ㎖ / 분의 유속에서, 차트의 전압이 제로 (+/- 0.5 단위)에 도달하기까지, 기준선 분광 광도계에 다이얼을 조정 조정. 주 : 삼각 플라스크에 폐기물 관에서 물 출구를 관찰합니다. '0.5'또는 '1.0'AU에 원하는 감도를 설정합니다. 참고 : 1.0 AU는 10 ml의 구배 10 OD 단위에 가장 적합합니다. OD가 10 미만이면, '0.5'신호 ​​감도를 향상시키기 위해 사용될 수있다. 자동베이스 라인 버튼을 누르고 (디지털 레코더를 사용하는 경우 선택 사양) 레코더 오프셋 다이얼을 돌려 차트 레코더의 10 % 표시로 설정 기준을 조정합니다. 안정적인 바탕이 달성되면 디지털 레코더를 사용하는 경우 아날로그 차트 레코더 또는 'OFF'를 사용하는 경우, 60cm / 시간에 'OFF'와 차트 단축 다이얼 펌프의 스위치를 켭니다. RE '에 펌프를 전환하여 추적 솔루션을 복구이 관통 정맥의 첫 번째 마크에 도달 할 때까지 (하나는 RAPID를 사용하지 마십시오 … 다시 6.0 ml / 분으로 유량을 증가시킬 수 있습니다 필요한 경우) V '위치. 원심 분리기 튜브를 제거하고 그것을 통해 추적 솔루션의 약간을 실행하여 정맥 내 공기 방울을 쫓아. 피어싱 단계를 깨끗하게 닦습니다. 참고 : 일부 잔류 물이 흐름 세포에서 누수 될 수 있습니다. 5. 그라데이션 분별과 샘플 컬렉션입니다. 설치 및 자당 구배를 포함하는 원심 분리 튜브를 관통. 캡이 위쪽으로 돌출하지 않도록 소수 컬렉터 트레이 위치 1-11 열한 2 ml의 마이크로 원심 튜브를 놓습니다. 컬렉터 튜브에 남아있는 액체를 수집하기 위해 '폐기물 관' '와 지금' '튜브 # 1' '교체합니다. '매뉴얼'을 펌프 제어 다이얼을 설정하고 '6.0 ml / 분'에 주사기 펌프 유량 </lI> 소수 컬렉터의 '재생'아이콘을 누릅니다. 즉시 팔 첫 번째 튜브에 도달로, ''일시 정지 '버튼을 누르면 (이 팔의 위치와 분수 – 분배 밸브를 엽니 다). ''FORWARD ''명령을 사용하여 펌프를 시작하고 차트 레코더 펜을 모니터링 할 수 있습니다. 이 위쪽으로 편향 시작되면 빠르게 '와'폐 튜브 '' ''튜브 # 1 ''교체 (즉 샘플을 분광 광도계의 플로우 셀을 통과 나타냄). 첫 번째 드롭가 수집되면, 신속하게 '원격 시작 / 정지', ''변수 (1.0 ml / 분) ''를 눌러 '재생'아이콘에 명령을 전환합니다. 참고 : 펌프가 이제 소수 컬렉터 인터페이스에 의해 제어되며, 1 ml의 분수는 모든 분을 수집됩니다. 이 시점에서, A260 수치는 디지털 레코더 인터페이스 (또는 아날로그 차트 recorde에 나타납니다R). ''기록 ''소프트웨어에 버튼을 누르면을 확인하십시오! 블루 체이스 솔루션은 수집 관 또는 마지막 튜브 (일반적으로 튜브 11)을 입력 한 후, '중지'아이콘을 누릅니다. 주 : 분배 밸브 폐기물 밸브로 전환해야합니다. 모든 그라데이션이 분별 될 때까지 얼음 분수를 유지합니다. 일 분획 끝에 종래 단백질 또는 RNA 분리 -80 ° C에서 저장 될 수있다. 단백질과 RNA 분석이 필요한 경우, 반 각 분획 (단백질 및 RNA 분석을 500 ㎕의 각)을 분할. 6. 세척 주 : (다수 그라데이션 수집 할있을 경우에만 수행 될 수있는 선택적인 단계 임). ~ 함유하는 삼각 플라스크에 초순수 50 ㎖를 폐 튜브 잠수함과 6 ml / 분의 유속을 사용하여 펌프를 역방향. 체이스 용액이 제 1 마크 오 도달 할 때 펌프를 중지N 관통 정맥. , 원심 분리기 튜브를 제거 캐 뉼러에서 모든 공기를 쫓아 피어싱 단계를 청소합니다. 참고 : 일부 잔류 물이 흐름 세포에서 누수 될 수 있습니다. 단계 5.1에서 시작하여 분류 절차를 반복합니다. 7. 최종 청소까지. 침의 바닥에서 펌프 호스를 분리하고 빠른 흐름 설정을 사용하여 50 ml의 원심 분리기 튜브에 추적 솔루션을 펌프. 다시 사용할 수있는 4 ° C에서 추적 솔루션을 저장합니다. 3 방법 튜브 시스템에 펌프 튜브를 연결하고 주사기로 이어지는 밸브를 닫습니다. 증류수와 침의베이스에 다른 튜브로 가득 50 ML의 주사기 하나의 튜브를 연결합니다. 블랭킹 공정에 사용되는 초 원심 튜브를 설치하고 '스타 클릭 인터페이스에서 수집 메뉴 분광 광도계와 포집 관 (스위치를 통해 증류수 적어도 50 ㎖ 합격T / 일시 정지 아이콘 ( '')). 다른 모든 이동식 구성 요소 (나사를 제거하는 데 사용하는 육각 렌치) 따뜻한 수돗물을 사용하여 철저하게 세척 한 후 초순수로 씻어 튜브, 주사기를 제거합니다. 참고 : 플런저, 배럴, 튜브의 세척 및 정맥을 관통 할 때 특별한주의하십시오. 참고 :주의 유리 주사기 배럴을 처리! 멀리 먼지의 모든 구성 요소를 저장합니다. 증류수에 적신 부드러운 티슈로 흐름 셀의 바닥을 닦습니다. 소수 컬렉터 트레이와 크로스가 유출되었을 수있는 다른 영역을 닦습니다. 자당 분수에서 RNA 8. 분리. (37.5 μL 10 % SDS, 7.5 μL의 0.5 M EDTA, 1 μL Glycoblue, 20 mg을 4 μL / ㎖ 프로 테 K) 자당 부분의 모든 1 ml를위한 프로 테 K 솔루션의 50 μl를 준비합니다. 2ml의 평바닥 튜브에서 55 ° C에서 1 ml의 프로 테이나 제 K를 용액 50㎕의 자당 분획을 부화1 시간 동안 (있는 경우 500 μL 분획 따라 테 K 용액의 양을 조정하여). 클로로포름 : 페놀 동량 추가 이소 아밀 알코올 분획에 자당 (125 : 24 일, 바람직하게는 산성 (pH를 4.5) DNA의 오염을 최소화하기 위해). 주 :이 무거워 단계가 반전 얻을 수 있기 때문에 분수 7-10 클로로포름의 추가 200 μl를 추가합니다. 주 : 페놀 / 클로로포름 접촉 및 흡입에 화상을 입을 수 있습니다. 실험실 코트, 안전 고글을 착용하고, fumehood를 사용합니다. 실온에서 5 분 동안 최대 속도에서 소용돌이 ~ 30 초간 원심 분리한다. ~ 수상 80 ~ 90 %가 제거 새로운 튜브 및 장소 (게놈 DNA를 포함 할 수있는 계면 만지지 마십시오). 클로로포름 단계를 반복 8.4의 동일한 볼륨을 추가합니다. 간기 않도록주의하면서 수상을 제거합니다. 3 M 아세트산 나트륨 1:10 부피, pH가 5.2를 추가 (또는 5 M 암모늄 아세테이트가 사용될 수있다). 냉장, absolu의 1.5 볼륨을 추가15 초 동안 테 에탄올과 소용돌이. -20 ° C (또는 -80 ° C에서 1 시간 러시의 경우)에서 하룻밤 침전. 참고 : 샘플에 남아있을 수 있습니다 -20 필요 이상 C를 °. 4 ℃에서 30 분 동안 최대 속도로 원심 분리기. 냉장 된 RNase가없는 70 % 에탄올 1 ml로 펠렛을 씻는다. 공기의 RNA 분해 효소가없는 물을 20 μL의 펠릿에 resuspend 건조. 적절한 수율 (A260 / 280 비율 기준) 순도를 보장하고 관심있는 mRNA를 (들)에 특정 동일 각 부분의 볼륨과 PCR 프라이머를 사용하여 표준 RT-qPCR의 분석 (14)에 진행 분광 광도법에 의해 총 RNA 정량화. 자당 분수에서 단백질 9. 절연. RNA 외에도, 단백질은 분리 될 수 있고,뿐만 아니라 개별적인 polysom​​e 분획에서 식별. 18 예를 들어, 단백질 분리에 사용할 수 많은 훌륭한 프로토콜 중 하나를 사용합니다.