Beoordeling van Selectieve mRNA Vertaling in zoogdiercellen door polysoom Profiling

Opmerking: Een opmerking over het werken met RNA: Neem standaard voorzorgsmaatregelen om te beschermen tegen RNA afbraak door RNases. Gebruik handschoenen, barrière pipet tips, RNase vrij plasticware en chemicaliën in alle stappen van het protocol. Gebruik ultrapuur of DEPC-behandeld water voor alle oplossingen. Ontsmet elk vermoeden van oppervlakken met RNase inactivatie oplossing volgens het protocol van de fabrikant. 1. Voorbereiding van Solutions. Bereid 500 ml basische oplossing (0,3 M NaCl;. 15 mM MgCl2 6H 2 O; 15 mM Tris-HCl, pH 7,4). Meng met behulp van een roerstaafje totdat de oplossing helder is en door een 0,45 pm filter. Bewaren bij kamertemperatuur. Bereid 10 en 50% sucrose en 60% oplossingen Chase oplossing als volgt: 10% sucrose-oplossing (w / v) in een 50 ml centrifugebuis 5 g sucrose en vul tot 50 ml met basische oplossing. 50% sucrose oplossing (w / v) in een 50 ml centrifugebuis advertentied 25 g sucrose en vul tot 50 ml met Basic Solution. 60% (w / v) Chase oplossing in een 50 ml centrifugebuis 30 g sucrose en vul tot 50 ml met basische oplossing. Voeg 100 ul van verzadigde broomfenolblauw-oplossing (voeg broomfenolblauw te water tot niet meer zal oplossen; centrifuge om het onopgelost poeder pellet) tot de 60% achtervolging oplossing. Meng met behulp van een vortex en controleer volledig oplossen. Winkeloplossingen bij 4 ° C totdat het nodig is. Bereid RNA lysisbuffer. Bereid deze buffer vers op de dag van het experiment. Bereid 500 ul van RNA lysisbuffer voor elk monster. Aan 1 ml van basische oplossing wordt 10 pl Triton X-100 (1% [v / v] def), 1 ui van 100 mg / ml cycloheximide in DMSO (CHX, 0,1 mg / ml uiteindelijk) en 3,5 ui RNasin (140 U / ml). Meng met behulp van een vortex. Houden op het ijs. OPMERKING: Cycloheximide is zeer giftig en kunnen mutaties veroorzaken. Vermijd contact met de huid en bij inademing. Om te voorkomen dat de behandeling van de poedervorm te vaak, prepzijn een grotere hoeveelheid van 100 mg / ml voorraad in DMSO, hoeveelheid en bewaar bij -80 ° C voor lange termijn opslag. Blijf werken voorraad bij -20 ° C. De dag van het experiment bereid Sucrose + CHX oplossingen door toevoeging CHX (eindconcentratie van 0,1 mg / ml) om het gewenste volume van 10% en 50% sucrose-oplossing (~ 7 ml van elke oplossing per gradiënt). 2. Voorbereiding van sucrosegradiënt behulp van een geautomatiseerd Gradient Maker Draai de gradiënt maker '' ON '' en het niveau van de plaat die de hellingen zal houden (criticalstep!) Klik op '' OK '' als plaat wordt genivelleerd. Selecteer in het menu de gradiënt programma uit te voeren: Druk op '' GRAD '' menu en selecteer '' LIST ''. Selecteer "SW41". Blader door de lijst en selecteer de ''10 – 50% helling – 11 stappen' 'programma door de persing van de 'RUN' 'knop'. Plaats een conische ultracentrifuge buis (SW-41 buis, 14 x 89 mm) in de Marker Block en gebruik de meegeleverde fijne buis marker om een ​​merk op te sporen op de buis langs de bovenste trede van het Marker Block. Plaats de buisjes in een passende rek op een stabiele ondergrond. OPMERKING: Dit merkteken zal de vulling gids voor gelaagdheid de 10 en 50% sucrose oplossingen. Bevestig de twee meegeleverde canule om twee 10 ml spuiten en wassen door en neer te pipetteren met warm gedestilleerd water met RNase inactivatie oplossing. Zorg ervoor dat u alle sporen van water achteraf te verwijderen. Vul een van de spuiten met 10% sucrose + CHX en plaats de canule onderaan de ultracentrifuge buis. Afzien zachtjes 10% sucrose oplossing totdat het gaat net voorbij de stempel op de buis. OPMERKING: Vermijd het maken van bubbels. Als er bellen te vormen, tik dan zachtjes buis om ze te verdringen. Vul de andere spuit met 50% sucrose + CHX, veeg extra vloeistof afmet een doekje en breng dan canule aan de onderkant van de ultracentrifuge buis. Afzien voorzichtig de 50% sucrose oplossing totdat het precies de markering bereikt. Snel en soepel te verwijderen van de canule. OPMERKING: De 10% sucrose moeten stijgen in de buis en vormt een meniscus op de bovenkant. Zo niet, voeg meer 10% sucrose oplossing op het oppervlak. Plaats de meegeleverde dop door het kantelen van de ultracentrifuge buis lichtjes en het verplaatsen van alle luchtbellen. Verwijder het teveel aan vloeistof in het reservoir van de dop met een micropipet. Veeg de overtollige vloeistof langs de buiswand en de plaats op de gradiënt maker plaat. Druk op de 'RUN' 'knop'. OPMERKING: De plaat zal kantelen bij de opgegeven hoek, pauze voor 5 sec en de rotaties te vormen van de helling begint. Wanneer gradiënt formatie compleet is (ongeveer 2 min, zal de machine een geluidssignaal), verwijder voorzichtig de ultracentrifuge (s), plaats op rek en snel te verwijderen dop in een opwaartse beweging om te voorkomen dat het verstoren van de Gradient. Houd gradiënt (s) op het ijs. Niet storen! Als alternatief gradiënten houden overnacht bij 4 ° C. U kunt ook gebruik maken van een twee kamer gradiënt maker om gradiënten te maken als volgt: Rinse slangen en gradiënt maker met RNase inactivatie oplossing en RNase-vrij water. Voeg 5 ml van 50% sucrose + CHX om proximale kamer van gradiënt maker en ervoor te zorgen dat alle lucht tussen de twee kamers is verwijderd. Voeg 5 ml van 10% sucrose + CHX tot distale kamer van gradiënt maker. Voeg 0,5 ml van 50% sucrose + CHX naar onderkant van een conische centrifugebuis (SW-41 buis, 14 x 89 mm) en plaats in de buishouder. Schakel roerder in proximale kamer, geopend stop-lullen en borg gradiënt te hebben op de snelheid ingesteld op "3" (ongeveer 1 ml / min). Plaats gradiënt (s) op het ijs. Niet storen. OPMERKING: Verlopen kan 's nachts worden bewaard bij 4 ° C. 3. Cell Lysis en Ultracentrifugatie. <ol style="Margin-left: 40px;"> Plaats SW-41 rotor en bakken bij 4 ° C en ingesteld centrifuge tot 4 ° C. OPMERKING: De cel lysis procedure is geoptimaliseerd voor twee 150 mm subconfluente (~ 70-80% confluent) platen van HEK293 cellen per gradiënt en de gebruikte hoeveelheden moet worden aangepast voor verschillende cellijnen. Cellaag op de juiste celdichtheid in de groeimedia ten minste 24 uur voorafgaand aan lysis. Bereid een aliquot (20 ml per 150 mm plaat) groeimedium dat 0,1 mg / ml CHX. Incubeer cellen in CHX + medium (20 ml per 150 mm plaat) gedurende 3 min bij 37 ° C / 5% CO 2 arrestatie en stabiliseren polysomen. Snel werkende, aspireren media uit platen, plaats platen op ijs en was cellen eenmaal met 10 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4) aangevuld met CHX (uiteindelijke concentratie van 0,1 mg / ml) en voorzichtig om langzaam pipet beneden de side van de schotel muur opheffing van de cel monolaag minimaliseren. Zuig PBS en voeg nog eens 10 ml PBS + CHX aan elke plaat, schraap cellen met een cel lifter en breng het totale volume van beide platen naar een centrifugebuis van 50 ml op ijs. Behoud 1 ml celsuspensie in een microfuge buis op ijs downstream eiwitanalyse. Centrifugeer de 50 ml buis cellen bij 300 g bij 4 ° C gedurende 10 min. Verwijder alle PBS en resuspendeer pellet in 500 pl ijskoude RNA lysisbuffer. Overdracht celsuspensie een 2 ml microcentrifugebuis. Pipet op en neer te lyseren cellen en incubeer op ijs gedurende 10 min met af en vortexen. Centrifugeer bij 2000 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten om kernen te pelletiseren. Breng supernatant naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 17.000 xg bij 4 ° C gedurende 5 min celresten pellet. Transfer supernatant naar een nieuwe 2 ml microcentrifugebuis en gebruik 2 pl te metenoptische dichtheid bij 260 nm (gebruik lysis buffer als blanco). Verwijder 50 pi (10% van het totaal) van elk monster voor analyse van totaal RNA. OPMERKING lysaat kan worden opgeslagen bij -80 ° C totdat het nodig is. Laden voorzichtig gelijk A260 eenheden op elke sucrose gradiënten (min 10 OD, optimaal 25 OD, in een maximaal volume van 500 pl;. Verdunnen geconcentreerde lysaat met extra lysis buffer indien nodig). Zorgen gradiënten op 0,1 g elkaar voor ultracentrifugatie. Centrifugeer gradiënten bij 39.000 rpm (260.343 x g) gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. Tijdens spindown houden rotor rem op en zet hem uit bij vertragen met het 1.000 tpm bereikt. OPMERKING: Deze stap minimaliseert dat verstoringen van de gradiënten veroorzaakt door abrupte veranderingen in de versnelling als de opzetborstels contact op met de rotor tijdens het remmen. 4. Gradient Fractionering System Instrument Set-up. Set-up van het instrument en blanco de spectrophotometer met water als volgt: Zet de onderdelen en laat de lamp op te warmen gedurende minstens 15 min. Zorg ervoor fractie collector is ingesteld op de 'polysoom' methode (persmap pictogram tweemaal; return pijl twee keer om terug te keren naar het startscherm). Zorg ervoor dat de klep op de fractie collector is ingesteld op (pijl naar prullenbak pictogram) verspillen. Plaats een erlenmeyer van 250 ml met gedestilleerd water onder de afvalinzameling buis. Selecteer de volgende instellingen op de recorder: Set gevoeligheid draaiknop om 'SET LAMP en optica'; ingesteld Noise filter schakelaar op '1.5'; ingesteld Peak separator draaiknop om 'OFF'; set Grafiek speed dial '30 cm / uur "(5 cm / 10 min); ingesteld Baseline Adjust knop (op de top van de spectrofotometer eenheid) om 'MAX OPEN'. OPMERKING: Optioneel: Een digitale recorder software kan worden gebruikt in plaats van de recorder. Op de computer, klikt u op 'Start'. Een overname venster zal openen: onder thmenu e-opties, uitvinken Pauze graphics. Onder Scaling, grenzen van de grafiek tot -10 en 100 (kan gewijzigd worden on-the-fly tijdens run). Klik op de knop Opslaan om een ​​nieuw bestand aan te maken en op te nemen van de run. Plaats de spuit en vat in de pomp en plaats aan te draaien (gebruik bijgeleverde schroeven en inbussleutel). OPMERKING: Niet te vast aandraaien. Vul de spuit met Chase Solution met behulp van de '' REV '' opdracht bij RAPID snelheid. Plaats de pomp in verticale positie en jagen lucht door de slang met behulp van de '' VOORUIT '' commando. Gebruik alleen RAPID voor deze functie en wast. Installeer een ultracentrifuge buis gevuld met RNase-vrij water. Pierce de ultracentrifuge buis met de canule tot de twee zwarte stippen zichtbaar (de verdeelopening ligt tussen deze twee markeringen) en start injectiepomp naar '' Manual 'bij 6,0 ml / min. Als het water door de stroomcel (bij chase oplossing vult 1/3 van de buis), schakelaar snelheid variabele en op 1,0 ml / min. Bij een stroomsnelheid van 1,0 ml / min, pas de Baseline Pas knop op de spectrofotometer totdat de spanning op de kaart op nul (+/- 0,5 eenheden). OPMERKING: Neem water exit uit het afval buis in de erlenmeyer. Stel de gewenste gevoeligheid voor '0.5' of '1.0' AU. OPMERKING: 1.0 AU beste werkt voor 10 OD-eenheden in een gradiënt van 10 ml. Wanneer OD kleiner is dan 10 '0,5' gevoeligheid kan worden gebruikt om het signaal te versterken. Druk op de Auto Baseline-knop en stel de basislijn instellen naar de 10% markering op de kaart recorder door de Recorder offset wijzerplaat (optioneel bij gebruik van de digitale recorder). Zodra een stabiele basislijn wordt bereikt, zet de schakelaar pomp op 'OFF' en de Chart Snelkeuze tot 60 cm / uur bij gebruik van de analoge recorder of 'UIT' bij gebruik van de digitale recorder. Recover de Chase Solution door over te schakelen pomp 'REV 'positie (indien nodig kan men debiet terug tot 6,0 ml / min te verhogen … NIET GEBRUIKEN RAPID) totdat het de eerste stempel op de piercing canule bereikt. Verwijder centrifugebuis en jaagt eventuele luchtbellen in de canule door het uitvoeren van een klein beetje van de Chase Solution doorheen. Veeg de piercing podium schoon. OPMERKING: Sommige restwater kan lekken uit de stroom cel. 5. Gradient Fractionering en verzamelen van monsters. Installeer en doorboren de centrifuge buis met de sucrose gradiënt. Plaats elf 2 ml microcentrifugebuisjes in de fractie collector tray posities 1-11 zodanig dat de doppen niet boven uitsteken. Vervang '' tube # 1 '' voor nu met een '' waste tube '' om van de vloeistof uit de collector buis te verzamelen. Stel de pompregeling draaiknop om 'Handmatig' en debiet op de injectiepomp te '6,0 ml / min' </li> Druk op het pictogram 'Play' op de fractie collector. Zodra de arm de eerste buis bereikt, drukt u op de 'pauze' knop '' (dit is de arm te positioneren en open de-fractie afgiftekraan). Start de pomp met behulp van de '' vooruit '' command en bewaken Grafiek recorder pen. Als het begint afbuigen naar boven (wat aangeeft dat monster is die door de stroom cel van de spectrofotometer), snel te vervangen '' afval buis '' met '' tube # 1 ''. Wanneer de eerste druppel wordt verzameld, snel schakelen opdrachten om 'Remote start / stop', '' Variable (1,0 ml / min) '' en druk op '' Play '' icoon. OPMERKING: De pomp wordt nu bestuurd door de fractie collector interface en 1 ml fracties zal elke min worden verzameld. Vanaf dit punt, zal A260 lezingen verschijnen op de digitale recorder interface (of de analoge grafiek recorder). Zorg ervoor dat de '' Record 'knop op de software wordt gedrukt! Na de blauwe Chase Solution komt in de verzamelbuis of de laatste buis (meestal buis 11), drukt u op de 'Stop' icoon. OPMERKING: De afgeefventiel moet schakelen om het afval klep. Blijf fracties op ijs totdat alle gradiënten werden gefractioneerd. Aan het eind van de dag fracties kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C voorafgaand aan eiwit of RNA isolatie. Als eiwit en RNA analyse vereist, verdeeld in elke fractie de helft (500 pi elk voor eiwitten en RNA analyse). 6. Was OPMERKING: (dit is een optionele stap om alleen worden uitgevoerd als er meerdere gradiënten moeten worden verzameld). Dompel het afval buis in de erlenmeyer met ~ 50 ml ultrapuur water en het ombuigen van de pomp met behulp van een 6 ml / min debiet. Stop de pomp wanneer de Chase Solution het eerste merk o bereiktn de piercing canule. Verwijder de centrifugebuis, jagen alle lucht uit de canule en het reinigen van de piercing podium. OPMERKING: Sommige restwater kan lekken uit de stroom cel. Herhaal de fractionering procedure vanaf stap 5.1. 7. Final Clean up. Koppel de pomp slang van de bodem van de piercer en pomp het Chase oplossing in een 50 ml centrifugebuis met de snelle stroom instelling. Bewaar de Chase oplossing bij 4 ° C als het kan worden hergebruikt. Sluit pompslang naar een 3-weg leidingsysteem en sluit de klep leidt naar de spuit. Sluit één buis in een 50 ml injectiespuit gevuld met gedestilleerd water en de andere buis naar de basis van de boor. Installeer de ultracentrifuge buis gebruikt voor de blanking stap en passeren ten minste 50 ml gedestilleerd water door de spectrofotometer en de collectie buis (schakelaar aan collectie menu op de interface door te klikken op de '' Start / Pause '' icoon). Verwijder buis, spuit (gebruik inbussleutel om de schroeven te verwijderen) en alle andere verwisselbare componenten en grondig wassen met warm water uit de kraan en spoel na met ultrapuur water. OPMERKING: Wees extra voorzichtig bij het wassen van de zuiger, cilinder, slangen en piercing canule. OPMERKING: Ga voorzichtig met de glazen cilinder met zorg! Bewaar alle onderdelen uit de buurt van stof. Veeg bodem van stroomcel met een zachte tissue bevochtigd met gedestilleerd water. Veeg de fractie collector tray en alle andere gebieden waar de sucrose kan zijn gemorst beneden. 8. Isolatie van RNA uit sucrose Breuken. Bereid 50 ui proteïnase K oplossing voor elke 1 ml van sucrose fractie (37,5 pl 10% SDS, 7,5 ui 0,5 M EDTA, 1 ui Glycoblue, 4 ui van 20 mg / ml Proteinase K). In 2 ml platbodem buis, incubeer 1 ml sucrose fractie met 50 ui proteïnase K-oplossing bij 55 ° Cgedurende 1 uur (bij gebruik van 500 ul fracties volume aanpassen van Proteïnase K oplossing dienovereenkomstig). Voeg een gelijk volume fenol: chloroform: isoamylalcohol om het sucrose fracties (125:: 24 1, bij voorkeur zure (pH 4,5) om DNA besmetting te minimaliseren). OPMERKING: Voeg een extra 200 ul van chloroform aan fracties 7-10, omdat ze zijn zwaarder en fasen kon krijgen omgekeerd. OPMERKING: fenol / chloroform kan brandwonden bij aanraking en inademing. Draag laboratoriumjas, veiligheidsbril, en gebruik een zuurkast. Vortex ~ 30 seconden en centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Verwijder ~ 80-90% van de waterfase (niet interphase aanraken die genomische DNA kunnen bevatten) en plaats in de nieuwe buis. Voeg een gelijk volume van chloroform en herhaal stap 8.4. Verwijder waterfase voorzichtig om interfase vermijden. Voeg 1:10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2 (alternatief 5 M ammoniumacetaat worden gebruikt). Voeg 1,5 volumes van gekoelde, absolute ethanol en vortex gedurende 15 seconden. Neerslaan overnacht bij -20 ° C (of 1 uur bij -80 ° C als in een rush). OPMERKING: De monsters kunnen in worden gelaten -20 ° C langer indien nodig. Centrifuge bij maximale snelheid gedurende 30 min bij 4 ° C. Was de pellet met 1 ml koud RNase-free 70% ethanol. Lucht droog de pellet en resuspendeer in 20 ul van RNase-vrij water. Kwantificeren totaal RNA spectrofotometrisch voldoende opbrengst en zuiverheid (gebaseerd op A260 / 280 ratio) garanderen en ga standaard RT-qPCR analyse 14 met gelijke volumes van elke fractie en PCR primers specifiek voor het mRNA (s) van belang. 9. Isolatie van Eiwitten uit sucrose Breuken. Naast RNA kunnen eiwitten worden geïsoleerd en geïdentificeerd in afzonderlijke fracties polysoom ook. Gebruik een van de vele uitstekende protocollen beschikbaar voor het eiwit afzonderlijk, bijvoorbeeld 18.