نماذج ثقافة الخلية توفر تحكم مفصلة على الظروف البيئية وبالتالي توفر منصة قوية لتوضيح جوانب عديدة من بيولوجيا الخلايا العصبية. نحن تصف طريقة سريعة وغير مكلفة، وموثوق بها لعزل وفصل، والثقافة الخلايا العصبية الحسية من الأجنة الفرخ. كما تقدم تفاصيل إعداد الطبقات التحتية ومناعية.
الخلايا العصبية هي الخلايا متعددة الأوجه التي تحمل المعلومات الأساسية لمجموعة متنوعة من المهام بما في ذلك الإحساس، وحركة السيارات، والتعلم، والذاكرة. يمكن دراسة الخلايا العصبية في الجسم الحي يكون تحديا بسبب تعقيدها، بيئاتها المتنوعة والديناميكية، والقيود الفنية. لهذه الأسباب، ودراسة الخلايا العصبية في المختبر يمكن أن يكون مفيدا لكشف أسرار معقدة من الخلايا العصبية. طبيعة محددة جيدا من نماذج ثقافة الخلية يوفر تحكم مفصلة على الظروف البيئية والمتغيرات. نحن هنا تصف كيفية عزل، فصل، والخلايا العصبية الثقافة الابتدائية من الأجنة الفرخ. هذا الأسلوب هو سريعة وغير مكلفة، ويولد تنمو بقوة الخلايا العصبية الحسية. الإجراء ينتج باستمرار الثقافات التي يتم التخصيب لديها الخلايا العصبية وعدد قليل جدا من الخلايا غير العصبية (أقل من 5٪). الخلايا العصبية الأولية لا تلتزم بشكل جيد للزجاج غير المعالجة أو زراعة الأنسجة البلاستيك، وبالتالي الإجراءات التفصيلية لإنشاء اثنين ديستانط، موصوفة محددة جيدا الطبقات التحتية التي تحتوي على laminin لطلاء الخلايا العصبية. الخلايا العصبية مثقف قابلة للغاية لتقنيات الخلوية والجزيئية متعددة، بما في ذلك التعاون مناعي، تخيل خلية الحية، رني، ومناعية. وقد تم تحسين إجراءات مناعية المزدوج على هذه الخلايا العصبية مثقف وصفها هنا.
الخلايا العصبية هي الخلايا المعقدة التي تحمل المعلومات الأساسية لمجموعة متنوعة من المهام بما في ذلك الإحساس، الرؤية، وحركة السيارات، والتعلم، والذاكرة. فريد من أنواع الخلايا الأخرى، تمتد عمليات الخلايا العصبية تشبه الذراع، ودعا محاور عصبية، لتشكيل العصبية الطرق الأساسية للاتصال. أثناء التطوير المتخصصة المقصورات الموجودة على نصائح من محاور النمو، دعا مخاريط النمو، انتقل من خلال الحفل من العظة خارج الخلية لقيادة محور عصبي إلى وجهتها المناسبة. ليست مفهومة تماما الآليات الجزيئية المعقدة التي تكمن وراء النمو مخروط الملاحة. إلى فهم أفضل لهذه الآليات، استخدمت محققين نماذج زراعة الخلايا لدراسة الخلايا العصبية في بيئة المختبر محددة ومبسطة في. وقد أدى دراسة الخلايا العصبية في الثقافة 1 إلى تقدم كبير في فهمنا لبيولوجيا الخلية العصبية بما في ذلك: تمايز الخلايا العصبية 2، وديناميات هيكل الخلية، الإلتقام والاتجار، التغصناتتنظيم 3،4، تجدد المحاور 5، والحالات السريرية مثل اعتلال الأعصاب 6. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا العصبية مثقف قابلة للغاية لمجموعة واسعة من تقنيات البحث بما في ذلك مناعية، خلية السطح المشترك مناعي، لطخة غربية، ترنسفكأيشن، رني، والتصوير الحي مثل تحليل timelapse من مخروط نمو الحركة. وهكذا، زراعة الخلايا العصبية الأولية هو نهج قوي لتوضيح جوانب عديدة من بيولوجيا الخلايا من الخلايا العصبية.
ويوفر نموذج خلية ثقافة المحققين مع سيطرة مفصلة على الظروف البيئية والمتغيرات. على سبيل المثال، والطبقات التحتية التي ومطلي الخلايا العصبية (وتنمو عليها) يمكن التلاعب بها بسهولة. هنا، ونحن نقدم تعليمات مفصلة لتوليد اثنين من الطبقات التحتية المتميزة، واحدة مع انخفاض laminin-1 تركيز والآخر مع تشبع تركيزات laminin-1. والمثير للدهشة، أن تركيزات مختلفة من نفس الجزيء لها آثار دراماتيكيةعلى الحالة الداخلية من الخلايا العصبية فضلا عن تكوين سطح الخلية الخاصة بهم. على سبيل المثال، مستويات الخلايا من المخيم ومستويات سطح integrins تختلف اختلافا كبيرا في الخلايا العصبية مطلي على هذين 7،8 الطبقات التحتية. وقد أظهرت دراسات إضافية أن الجزيئات الأخرى، بما في ذلك فبرونيكتين وكبريتات شوندروتن البروتيوغليكان، تأثير التعبير عن جزيئات سطح الخلية والحركة العصبية 7-11. بالإضافة إلى ذلك، جزيئات قابلة للذوبان مثل neurotrophins وneurotropins تؤثر أيضا تكوين غشاء الخلية العصبية والحركة 12-16 ويمكن بسهولة وبدقة التلاعب في نموذج ثقافة الخلية.
هنا، نحن تصف طرق لعزل وفصلها الثقافة الخلايا العصبية الحسية من الأجنة الفرخ. وقد استخدم هذا الإجراء لتحقيق اختراقات كبيرة في بيولوجيا الأعصاب، بما في ذلك محور عصبي ثمرة 5،7،8،10،11،16-21 وتم تعديل من إجراء يهدف إلى عزل خلايا العقدة 22. هناكالعديد من المزايا لهذا النهج. أولا، العديد من الميزات من الفرخ عقدة الجذر الظهري (DRG) تطوير تتميز جيدا بما في ذلك الإطار الزمني للولادة، والإرشاد محور عصبي، وملامح تعبير البروتين 2،23-28، وبالتالي توفير أساس المفيد التي تبنى عليها بالمعلومات في تجارب المختبر. الثانية، فصل الثقافات العصبية تسمح المحقق لدراسة الخلايا العصبية أكثر مباشرة مقارنة النهج البديلة باستخدام إإكسبلنتس سليمة DRG (التي تحتوي على الخلايا العصبية والخلايا غير العصبية) و / أو الثقافات المختلطة التي تحتوي على كل من الخلايا العصبية وفصلها الخلايا غير العصبية. ثالثا، الإجراء الموضح هنا واضح ومباشر، وغير مكلفة وقابلة للطلاب الجامعيين. ولذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها لأغراض البحث وكذلك لأغراض تعليمية. وعلاوة على ذلك، يجب أن اختلافات طفيفة من هذا البروتوكول يسمح تنقية سريع، عالية الغلة من الخلايا العصبية من مصادر أخرى غير DRGs. على سبيل المثال، يمكن تعديل هذا الإجراء لتوفير neuronally ENRالثقافات iched من الأنسجة الأخرى مثل الدماغ الأمامي الجنينية أو الحبل الشوكي.
وقد تم تحسين بروتوكولات مناعية لهذه الثقافات العصبية فصلها ويتم وصفها بالتفصيل هنا. يتم توفير إجراءات مناعية المزدوج ضد جزيء التصاق الخلايا العصبية (NCAM) وintegrins β1. وقد استخدمت البيانات الناتجة من هذه الأساليب immunocytochemical لدراسة الزخرفة المكانية وكثافة عدة الجزيئات في الخلايا العصبية مثقف 8،16.
هنا نقدم بروتوكولات مفصلة لعزل وزراعة الخلايا العصبية الحسية فصلها من جنين الفرخ. يولد هذا الإجراء السكان المخصب من الخلايا العصبية المتنامية بقوة في المختبر 7،8،10،16. العديد من التقنيات الخلوية والجزيئية يمكن تطبيقها على هذه الخلايا العصبية مثقف، بما في ?…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر أليسون Philbrook، بليندا Barbagallo ومايكل فرانسيس للتعليقات الثاقبة على هذه الورقة. وأيد البحث عنها في هذا المنشور من قبل جائزة R15 AREA 1R15NS070172-01A1 منحت لMLL.
sterile small culture dishes (35mm) | Corning | 430165 | |
sterile large culture dishes (100mm) | Falcon | 353003 | |
sterile large petri dishes (100mm) | VWR | 89000-302 | |
glass petri dish (100mm) | VWR | D108962 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
coverslips (22×22) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media |
HCL | VWR | VW3204-1 | use at 2M, can be used twice before discarding |
NaCl | Sigma | S9888 | use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul |
15 ml conical tube | cell treat | 229411 | |
PBS CMF 10X | Gibco | 14200 | used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water |
PBS 10X | Gibco | 14080 | used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water |
Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM |
Penicillin streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5mls in 500mls of F12 media |
NT3 | Millipore | GF031 | Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C non-defrosting freezer |
N2 | Invitrogen | 17502048 | aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C, use 100ul per 10ml of F12H media |
NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
l-glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media |
Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
Other items needed: general dissection instruments, including glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37 degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
Immunocytochemistry Reagents Table | |||
Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
microscope slides | VWR | 16004-430 | |
Primary Antibody Table | |||
Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
Antibody against activated beta 1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
Seconday Antibody Table | |||
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 |