Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.
Neuronen zijn veelzijdige cellen die informatie essentieel is voor een verscheidenheid aan functies, waaronder sensatie, motoriek, leren en geheugen uit te voeren. Studeren neuronen in vivo kan lastig zijn vanwege hun complexiteit, hun gevarieerde en dynamische omgevingen, en technische beperkingen. Daarom bestuderen neuronen in vitro gunstig kan blijken om de complexe geheimen van neuronen ontrafelen. De goed gedefinieerde aard van celcultuur modellen biedt gedetailleerde controle over de milieu-omstandigheden en variabelen. Hier beschrijven we hoe te isoleren, distantiëren, en cultuur primaire neuronen van kippenembryo's. Deze techniek is snel, goedkoop en genereert stevig groeiende sensorische neuronen. De procedure produceert vaste culturen die sterk verrijkt voor neuronen en heeft zeer weinig niet-neuronale cellen (minder dan 5%). Primaire neuronen niet goed aan onbehandelde glas of weefselkweek plastic derhalve gedetailleerde procedures twee Distin creërenct, goed gedefinieerde-laminin bevatten substrata voor neuronale plating worden beschreven. Gekweekte neuronen zijn zeer vatbaar voor meerdere cellulaire en moleculaire technieken, met inbegrip van co-immunoprecipitatie, live cell verbeelden, RNAi, en immunocytochemie. Procedures voor dubbel immunocytochemie volgende gekweekte neuronen werden geoptimaliseerd en beschreven.
Neuronen zijn complexe cellen die informatie essentieel is voor een verscheidenheid aan functies, waaronder sensatie, visie, motoriek, leren en geheugen uit te voeren. Unieke van andere celtypen, neuronen verlengen arm-achtige processen axonen, essentiële neurale snelwegen communicatie vormen. Tijdens de ontwikkeling van gespecialiseerde compartimenten zich aan de uiteinden van de groeiende axonen, de zogenaamde groei kegels, navigeren door een concert van extracellulaire signalen naar de axon naar de juiste bestemming te leiden. De ingewikkelde moleculaire mechanismen die groeikegel navigatie grondslag liggen zijn niet volledig begrepen. Om beter te begrijpen van deze mechanismen, hebben de onderzoekers gebruikt celcultuur modellen voor neuronen in een gedefinieerde en vereenvoudigde in vitro-omgeving te bestuderen. Studeren neuronen in cultuur 1 heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de neuronale celbiologie waaronder: neuronale differentiatie 2, cytoskelet dynamiek, endocytose en mensenhandel, dendrietregulatie 3,4, axonale regeneratie 5, en klinische aandoeningen zoals neuropathieën 6. Bovendien gekweekte neuronen zeer vatbaar voor diverse onderzoekstechnieken zoals immunocytochemie, celoppervlak co-immunoprecipitatie, Western blot, transfectie, RNAi en levende imaging zoals timelapse analyse van groeikegel motiliteit. Aldus kweken van primaire neuronen is een krachtige aanpak talrijke aspecten van de celbiologie van neuronen helderen.
De celcultuur model biedt onderzoekers met gedetailleerde controle over de milieu-omstandigheden en variabelen. Bijvoorbeeld kan het substraat waarop neuronen uitgeplaat (en groeien op) gemakkelijk worden gemanipuleerd. Hier geven we gedetailleerde instructies voor het genereren van twee verschillende substraten, een met een lage concentratie laminine-1 en de andere met verzadigende concentraties van laminine-1. Verrassenderwijs kunnen verschillende concentraties van hetzelfde molecuul dramatische effectende interne toestand van neuronen en hun celoppervlak samenstelling. Bijvoorbeeld, intracellulaire niveaus van cAMP en maaivelden integrines significant verschillend in neuronen uitgeplaat op beide substraten 7,8. Aanvullende studies hebben aangetoond dat andere moleculen, waaronder fibronectine en chondroïtinesulfaat proteoglycanen, effect de expressie van celoppervlak moleculen en neuronale motiliteit 7-11. Bovendien oplosbare moleculen zoals neurotrofinen en neurotropins ook gevolgen celmembraan preparaat en neuronale beweeglijkheid 12-16 en kan gemakkelijk en nauwkeurig gemanipuleerd in een cel cultuurmodel.
Hier beschrijven we methoden om te isoleren en cultuur los sensorische neuronen van kippenembryo's. Deze procedure is gebruikt om belangrijke doorbraken in neurobiologie, inclusief axon uitgroei 5,7,8,10,11,16-21 maken en is een modificatie van een procedure die tot ganglioncellen 22 isoleren. Er zijnverscheidene voordelen aan deze aanpak. Ten eerste zijn veel kenmerken van chick dorsale wortel ganglion (DRG) ontwikkeling goed gekarakteriseerd, waaronder de termijn voor de geboorte, axon extensie, en eiwit expressie profielen 2,23-28, waardoor het een leerzame basis waarop te bouwen informatieve in vitro experimenten. Ten tweede, gedissocieerd neuronale kweken kan de onderzoeker directer bestuderen neuronen vergelijking met alternatieve benaderingen waarbij intacte DRG-explantaten (welke neuronen en niet-neuronale cellen bevatten) en / of gemengde kweken die zowel gedissocieerde neuronen en niet-neuronale cellen. Ten derde, de hier beschreven procedure is eenvoudig, goedkoop en vatbaar voor studenten. Daarom kan deze techniek worden gebruikt voor onderzoek en voor onderwijsdoeleinden. Bovendien moet kleine wijzigingen van dit protocol snelle, hoge opbrengst zuivering van neuronen uit andere dan DRGs bronnen toestaan. Bijvoorbeeld kan deze procedure worden aangepast om neuronaal verschaffen Enriched kweken van andere weefsels zoals embryonale voorhersenen of ruggenmerg.
Immunocytochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor deze gedissocieerde neuronale kweken en worden in detail beschreven hier. De procedure voor twee immunocytochemie tegen neurale cel adhesiemolecuul (NCAM) en β1 integrines voorzien. Het genereren van deze immunocytochemische werkwijzen zijn gebruikt om de ruimtelijke patronen en intensiteit van verscheidene moleculen in gekweekte neuronen 8,16 onderzoeken.
Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen voor het isoleren en kweken los sensorische neuronen van een kippenembryo. Deze procedure genereert een verrijkte populatie van stevig groeiende neuronen in vitro 7,8,10,16. Vele cellulaire en moleculaire technieken kunnen worden toegepast op deze gekweekte neuronen, waaronder immunocytochemie, die hier wordt beschreven. Dit protocol werd onlangs gebruikt om de intensiteit van immunologisch actieve integrinen sensorische groei kegels 8,16 kwa…
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Alison Philbrook, Belinda Barbagallo en Michael Francis bedanken voor inzichtelijke reacties op dit papier. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door een R15 AREA award 1R15NS070172-01A1 toegekend aan MLL.
sterile small culture dishes (35mm) | Corning | 430165 | |
sterile large culture dishes (100mm) | Falcon | 353003 | |
sterile large petri dishes (100mm) | VWR | 89000-302 | |
glass petri dish (100mm) | VWR | D108962 | |
fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
coverslips (22×22) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50ml aliquots per 500 mls of Ham's F12 media |
HCL | VWR | VW3204-1 | use at 2M, can be used twice before discarding |
NaCl | Sigma | S9888 | use 5M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72ul of sterile 5M NaCl and aliquot into 50ul |
15 ml conical tube | cell treat | 229411 | |
PBS CMF 10X | Gibco | 14200 | used at 1X, dilute with sterile millipore filtered water |
PBS 10X | Gibco | 14080 | used at 1X, dilute with sterile milliporee filtered water |
Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10mM |
Penicillin streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5mls in 500mls of F12 media |
NT3 | Millipore | GF031 | Add 1ml of sterile millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 10ng/ml in F12H media, keep in -20 C non-defrosting freezer |
N2 | Invitrogen | 17502048 | aliquot under sterile conditions,stored at -20 0C, use 100ul per 10ml of F12H media |
NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1ml of sterile 1X PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, usd at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
l-glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C, use at final concentration of 200mM in F12H media |
Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 0C |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
Other items needed: general dissection instruments, including glass pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 degrees C), cell incubation chamber (humidified, 37 degrees C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
Immunocytochemistry Reagents Table | |||
Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2X PBS) |
Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
microscope slides | VWR | 16004-430 | |
Primary Antibody Table | |||
Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
Antibody against activated beta 1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
Seconday Antibody Table | |||
Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 |