Diş kompozit biyouyumluluk en çok çalışılan yönü floresan sinyal ölçümü ile birlikte kendi sitotoksisite 3D CLSM time lapse görüntüleme zamanla hücre kaderinin duyarlı değerlendirilmesine olanak olduğunu. Bu yöntemi kullanan diş kompozit cytocompatibility değerlendirmek için etkili bir araç olabilir.
Bu genel olarak in vitro hücre malzemesi etkileşimi diş malzemesi biyouyumluluk değerlendirilmesinde yararlı bir kriter olduğu kabul edilmektedir. Bu çalışmanın amacı, diş kompozitlerin in vitro biyolojik uyumluluğunun değerlendirmek için 3 boyutlu CLSM zaman atlamalı confocal görüntüleme kullanmaktı. Bu yöntem, diş bileşik özleri ile temas içinde canlı hücre oranının doğru ve hassas bir göstergesi sağlar. ELS ekstra düşük büzülme, doğrudan restorasyonu için kullanılan bir diş kompozit, örnek olarak alınmıştır. In vitro değerlendirme Live / Dead boyası kullanılarak kültüre birincil insan dişeti fibroblast hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Görüntüler FV10i confocal biyolojik ters sistemi ile elde ve FV10-ASW 3.1 Yazılımı ile analiz edildi. Görüntü analizi süreye 5 saat sonra, test edilen bileşiğin varlığında, çok hafif bir sitotoksisite göstermiştir. Hücre canlılığı hafif bir azalma, test edilen bileşik özütler karş ile temas halinde gösterilmiştired hücreleri kontrol etmek. Bulgular niteliksel ve niceliksel olarak diş kompozit biyouyumluluk davranışlarını değerlendirmek için hassas bir yöntem olarak 3D CLSM time lapse görüntüleme vurguluyor.
Biyouyumluluk tanımlamak için ISO önerileri kote önemli ölçütlerden biri, hücrelere malzeme toksisite olmaması. Reçine tabanlı diş kompozitler zaman 1-4 üzerinde ve / ya da geç bozunma süreçleri kısmi polimerizasyon başlangıçta nedeniyle olabilir reçineli matrisi bileşenleri, bırakabilir. Bu serbest bileşenler ağız dokuları ile temas ve ürtikeryal ve mukozal reaksiyonlar 5 hastada 6 alerji ve aşırı duyarlılık reaksiyonları geliştirilmesi, mitojene üzerinde tipine dişeti fibroblastlar morfolojisi ve azaltılması modifikasyonları I kollajen protein 7, immünosüpresyonun veya immünostimülasyon gibi çeşitli sakıncaları olabilir genotoksik potansiyel 9 altını saflaştırılmış T-lenfositler ve dalak hücreleri 8 ve primer GF'lerinin DNA hasarı -sürümlü çoğalması. Birçok parametreler gibi c gölge gibi diş kompozit toksisitesini etkileyebiliromposite, ışıkla sertleşen reçine monomer kimyasal bileşim olup, dolgu maddesi ve dönüşüm 10- 13 derecesine bağlıdır. Malzemelerin in vitro toksik potansiyel vivo durumlarda tahmin ve bazı ilgili son noktaların çalışmada klinik durumlara göre olabilir çünkü. Diş bileşikler ve bunların bileşenleri sitotoksisitesi yaygın olarak hücre kültür sistemleri 14- 16 ile değerlendirilmiştir.
Bu in vitro sistemler vadede diş kompozit biyolojik uyumu değerlendirmek için geliştirilmiştir: hücre büyümesi ve hücre apoptozu, hücreler 17 gibi, THP-1monocytes kullanılarak GF'lerinin 18 sitotoksisite, HaCaT'ta inflammatuar potensiyelleri hücreler 2, hücre fonksiyonu gibi keratinositler odontoblast- MDPC-23 hücreleri 19 toplam RNA seviyelerinin azaltılması ve insan dişeti apoptoz indüklenmesinde önemli bir artış gibi keratinositler, 20 veDişeti ve posa fibroblast hücreleri 21 DNA hasarı.
Farklı yöntemler diş kompozit biyouyumluluk araştırmak için önerilmektedir. Belirli bir renklendirici ve hafif tutma ölçümleri gibi kolorimetrik tahlilleri, nedeniyle göreli olarak basit ve düşük maliyetli 22 ila 26, en yaygın olarak kullanılan kalır. Işık aksine mikroskopisi analizi sık sık daha fazla zaman harcar ve yüksek maliyetler doğurur. Ancak, bu mikroskopi teknikleri bazı önemli avantajları var. Hücre yapısının gözlem, böylece daha ilgili ve hassas veriler sağlayan, deneyimli toksik etkileri hakkında genişletilmiş bilgi verir. Özellikle, konfokal mikroskopi 27 giriş, geleneksel geniş alan görüntüleme floresan mikroskopları ile karşılaştırıldığında eksenel çözünürlüğünü artırılması ile biyolojik yapıların gözlem için izin verdi. Dolayısıyla, konfokal görüntüleme farklı alanlarında güçlü bir araştırma aracı haline gelmiştirtıbbi ve bilimsel araştırmalar. Elektronik mikroskopi teknikleri farklı olarak, tarama, konfokal mikroskopi özel flüoresan işaretler dahil edilmesi ile hücrelerin ayrı bileşenleri görselleştirmek için olanağı sunar. Bu özel izleyici çoğu klinik kullanım alanı ve ayrıca laboratuar araştırma çalışmaları sağlayan, bir sulu ortam içinde kararlı makul ölçülebilir, ucuz ve 28 toksik olmayan. Ayrıca, geleneksel bir elektronik mikroskopi analizi için gerekli olan numune kurutma ve fikse zaman atlamalı konfokal görüntüleme için gerekli değildir, ve böylece zaman bağımlı alıcı numuneleri üzerinde de mümkündür. İki-boyutlu görüntü ile karşılaştırıldığında, konfokal görüntüleme maddenin, örnek altı görselleştirme ve farklı edilen derinlik görüntüleri üç-boyutlu yapı, yeniden sağlar; ile sonuçlanan, daha hassas ve daha fazla sayıda yapısal detayları 29, 30. Mevcut Video Çalışma üç boyutlu Hızlandırılmış C kullanımının bir örneğiyenilikçi bir yöntem olarak Dead / Canlı floresan etiketleme ve sinyal ölçümü ile kombine onfocal Lazer Tarama Mikroskobu (3D-CLSM). Bu çalışmada sunulan teknik değerlendirilen hücre yapısını değiştirmeden canlı hücreleri hassas değerlendirilmesi ve time-lapse görüntüleme avantajına sahiptir. Hiçbir hazırlık adımları confocal analizden önce gereklidir. Daha önce, aynı boyama kültürlenmiş süngerimsi kemik çekirdek 31 uygunluğu değerlendirmek için, ancak şu konfokal hızlandırılmış kullanılmıştır. Benzer şekilde, aynı time-lapse konfokal prosedürü / belirli bir bakteri yaşıyor ölü boyama kullanarak kendi Gram türüne 32'ye göre aktif çamur bakterilerde eritromisin zaman öldürmek aktivitesini değerlendirmek için kullanıldı. Bu yöntemler, son uyarlanmıştır ve metakrilat monomerlere 11 göre diş kompozit toksisitesini karşılaştırmak için kullanılmıştır.
Biyouyumluluk malzeme davranışı tıbbi kullanımdan önce değerlendirilecek en önkoşul parametredir. Uluslararası standartlar tıbbi cihazlar ISO 10993 33 ve özellikle diş malzemeleri ISO 7405 34 kapsayacak. Çevreleyen hücrelere toksik etkilerin olmaması gibi malzemelerin biyouyumluluk değerlendirilmesinde anahtar norm. 37 – sitotoksisite testi diş malzeme biyouyumluluk 35 değerlendirilmesinde böyle bir öneme sahip nedeni budur. ISO test yöntemleri metabolik aktivite veya membran bütünlüğü temelinde olabilir önerdi. Seçilen uç noktalar zaman ve değerlendirme testlerinin maliyetini en aza indirmek için bir test malzeme ile uyarılan olumsuz etkilere sıralaması için belirli koşulları takip edilmelidir. Soruşturmanın akım yöntemi (3D konfokal time lapse görüntüleme) esaslı membran bütünlüğü olduğunu. Bu uç aracılığı ile sitotoksisite değerlendirilmesi hücre, biyolojik uyumluluğu değerli bir belirteç olarak görülmektedirTest edilen malzeme ve bunun ile sürülenlerden aynı zamanda ISO son nokta onaylanmıştır. İn vitro testler, bir malzeme örneği, özel bir hücre tipi nasıl etki ettiğinin saptanması için tasarlanmıştır. Kolorimetrik MTT deneyi ilk olarak in vitro ve hücre proliferasyonunun ölçülmesi için yararlı bir yöntem olarak (1983) Mossman tarafından tarif edilmiştir. MTT testi mitokondriyal aktivite belirlenerek aktif hücrelerin formazan kristalleri içine tetrazolyum tuzunun dönüştürülmesi, dayanmaktadır. Bu canlılığı oranı 38 ile tercüme edilebilir. Gupta ve işbirlikçileri MTT testi kompozit reçine sitotoksikligini ölçmek için en yaygın kullanılan yöntem olduğunu bildirdi. Süksinik dehidrojenaz ve alkalin fosfataz tepkileri ayrıca aynı amaç 39 kullanılmıştır. MTT deneyi her ölçüm zamanında hücreleri öldürerek gerektirmektedir Bununla birlikte, kaderin hücre, takip edilemez. Mevcut çalışmada daha yakından boyanmış hücrelerin davranışını izlemek için, DiCanlı hücrelerin rect gözlem, kısa protokol boyama, otomatik görüntü analizi ve floresan sinyal ölçümü ile kombine time lapse CLSM görüntüleme sayesinde gerçekleştirildi.
Diş kompozitler oral dokular, özellikle dişeti ve pulpa hücreleri ile yakın temas. 41 – Fibroblast'lar Bu restoratif kompozit 40 serbest bileşenlerin hedef olacaktır. Ayrıca birkaç çalışma, ölümsüzleştirilmiş hücreler ve birincil hücreler biyomalzeme ile temas içinde değişik hücresel tepkiler sahip olduğu belirtilmektedir. Birincil hücreler biyomaddeleri etkileri 42 değerlendirmek için daha uygun olduğu saptanmıştır. Bu, bu çalışmada test edilen diş kompozitin sitotoksisite değerlendirmesi için hücre modeli olarak primer insan diş eti fibroblast hücrelerinin kullanımını açıklar. 44 – Diş kompozit salınan maddelerin toksisitesi potansiyel geniş 43 incelenmiştir. T değerlendirmek içinUygun malzeme potansiyelini sitotoksik, iki temas modeli hücre gerçekleştirilebilir. Dolaylı temas sistemindeki hücreler, biyolojik ortamda elute olur temas eden hedef ise doğrudan temas modeli sisteminde malzeme doğrudan hedef hücreler ile yerleştirilir. Klinik uygulamada ve restoratif prosedürler için, diş kompozit diş eti dokuları ile dolaylı olarak temas edecek şekilde yerleştirilir. Bu nedenle, mevcut deneysel protokol (test kompozit özleri varlığında hücreler) GF'lerinin ile dolaylı temas sistemi üzerinde duruldu. Daha önce Dahl ve işbirlikçileri tarafından bildirildiği gibi, sitotoksisite yanıtları için faaliyet göreceli dayalı <(% 90), (30% orta (% 30-60), hafif (% 60-90) veya non-sitotoksik)> ciddi olarak sıralanır edildi değerleri kontrol 45 elde edildi. Bu nedenle, elde edilen sonuçların ışığında (Tablo 1) Bu sıralama ve uygun, kompozit ELS ekstra düşük büzülme ver olarak sıralanır olabiliry hafifçe sitotoksik ve tüm zaman atlamalı dönemde hücreleri kontrol karşılaştırılabilir davranış gösterdi. Tam aynı araştırma yöntemi kullanarak, bu çalışmanın sonuçları yakın zamanda yayımlanan bir çalışmada kıyasla olabilir. ELS ekstra düşük büzülme kompozit doğrudan restorasyon 11, aynı klinik uygulama için kullanılan iki önce test kompozitlerle karşılaştırıldığında üstün bir biyouyumluluk göstermiştir. Daha ileri çalışmalar daha da tam bir karşılaştırma oluşturmak için gereklidir.
Belirli bir son nokta değerlendirme için onaylamak için hangi sitotoksisite deneyi karar verirken, bu avantaj ve her testin sınırlarını anlamak önemlidir. Konfokal görüntüleme temel amacı, hücre ya da organların bir 3-D Mimari elde etmektir. Teknik Numunenin yüzeyine değil, aynı zamanda onun yeraltını sadece ortaya yapabiliyor. Burada açıklanan protokol, bir sensi olarak, 3D CLSM time lapse konfokal görüntüleme kullanımını altını çizentif yöntem, bir diş bileşik in vitro olarak biyolojik uyum davranışını değerlendirmek. Bununla birlikte, bu çalışmada karşılaşılan sınırlamalar önlemek amacıyla, titreşim önleyici iş istasyonları daha istikrarlı ve daha uzun bir zaman aralığı görüntülenmesine olanak sağlamak için kullanılabilir; masa laboratuvarda titreşimler neden olabilir zararlı etkilerinden kullanılan confocal sistemini izole olabilir. Ayrıca, malzeme ideal olarak diş eti dokulara zararsız olmalıdır, ağız boşluğunda kullanılmak üzere, sistemik toksisiteye neden olabilir hiçbir madde içermelidir. Kullanılan metodolojiye göre ve mevcut çalışmadan elde edilen sonuçlarda bu test kompozit (ELS ekstra düşük büzülme) Bu deneysel koşullarda sitotoksik olmadığı sonucuna varılabilir. CLSM yöntem, hassas bir canlı hücrelerinin ilk oran vermek üzere, diğer olasılıklar daha fazla bitiş noktası değerlendirmek için öngörülebilir. Özellikle, son zamanlarda rapor edilmiştir kompozit monomerleri thr hücrelerini etkileyenough reaktif oksijen türleri (ROS) 46- 48, daha fazla araştırma sitotoksisite arasında herhangi ağları ve ROS üretimini sinyalizasyon eğer ilişkiyi değerlendirmek için gereklidir. Gelecekteki protokolü aynı anda ROS üretimini değerlendirmek için (H 2 O 2 ve / veya O 2 – boyama) dizayn edilebilir ve zaman atlamalı CLSM görüntüleme kullanılarak sitotoksisite oranı (Canlı / ölü boyama).
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |