الجانب الأكثر درس من توافق مع الحياة من المواد المركبة الأسنان هو السمسة 3D CLSM الوقت الفاصل بين التصوير الخاصة بهم جنبا إلى جنب مع فلوري الكمي إشارة يسمح تقييم حساسية في مصير الخلايا مع مرور الوقت. يمكن استخدام هذه الطريقة تكون أداة فعالة لتقييم cytocompatibility من المواد المركبة الأسنان.
ومن المسلم به عموما أن التفاعل في المختبر مادة الخلية هو المعيار مفيدا في تقييم الأسنان توافق مع الحياة المادية. كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام 3D CLSM وقت التصوير مرور متحد البؤر لتقييم توافق مع الحياة في المختبر من مركبات الأسنان. وهذه الطريقة توفر مؤشرا دقيقا وحساسا من معدل خلية قابلة للحياة في اتصال مع مقتطفات مركب الأسنان. وELS انكماش منخفضة خارج، وهو مركب يستخدم لترميم الأسنان مباشرة، اتخذت كمثال. تم إجراء التقييم في المختبر على خلايا الليفية مثقف الأولية الإنسان اللثة باستخدام ايف / تلطيخ الميت. تم الحصول على الصور مع النظام البيولوجي متحد البؤر FV10i مقلوب وتحليلها مع FV10-ASW 3.1 البرمجيات. وأظهر تحليل الصور والسمية الخلوية الطفيفة جدا في وجود مركب اختبار بعد 5 ساعات من وقت مضي. وقد أظهرت انخفاض طفيف في بقاء الخلية على اتصال مع مقتطفات مركب compar اختبارإد للسيطرة على الخلايا. أبرزت نتائج استخدام 3D CLSM التصوير الفاصل الزمني كوسيلة حساسة نوعيا وكميا لتقييم السلوك توافق مع الحياة من المواد المركبة الأسنان.
واحدة من المعايير الرئيسية المدرجة في التوصيات ISO لتحديد توافق مع الحياة هو غياب سمية المواد إلى الخلايا. للراتنجات المركبة الأسنان قد تطلق سراح عناصر من المصفوفة راتنجية، التي يمكن أن تكون بسبب البداية إلى البلمرة الجزئية، و / أو في وقت لاحق بسبب عمليات التدهور بمرور الوقت 1-4. هذه المكونات صدر تتلامس مع أنسجة الفم ويمكن لها عيوب مختلفة مثل التفاعلات الشروية و5 المخاطية، وتنمية الحساسية وفرط الحساسية ردود الفعل في 6 مرضى أو تعديلات من الخلايا الليفية اللثة التشكل والحد على النوع الأول الكولاجين بروتين 7، كبت المناعة أو تنبيه المناعة على mitogen -driven انتشار تنقية الخلايا اللمفاوية التائية وخلايا الطحال (8) والحمض النووي من التلف في الخلايا الليفية اللثة الإنسان الأساسية، وهو ما يؤكد على السمية الجينية المحتملة 9. يمكن أن العديد من المعلمات تؤثر سمية مركب الأسنان مثل الظل من جomposite، وعلاج الخفيفة، والتركيب الكيميائي للمونومر الراتنج، حشو ودرجة تحويل 10- 13. منذ إمكانات في المختبر من المواد السامة يمكن التنبؤ في حالات المجراة ويمكن مقارنة الحالات السريرية من خلال دراسة بعض النقاط الطرفية ذات الصلة. وسمية الخلايا من المواد المركبة الأسنان ومكوناتها تم تقييمها على نطاق واسع باستخدام أنظمة زراعة الخلايا 14- 16.
وقد تم تطوير هذه الأنظمة في المختبر لتقييم توافق مع الحياة المركبة الأسنان في مدة: نمو الخلايا وموت الخلايا المبرمج الخلية باستخدام THP-1monocytes مثل خلايا 17، سمية الخلايا الليفية في اللثة الإنسان 18، وإمكانات التهابات في القرنية مثل خلايا HaCaT 2، وظائف الخلية odontoblast- مثل MDPC 23 19 خلايا، والحد من إجمالي مستويات RNA، وزيادة كبيرة في استحثاث موت الخلايا المبرمج على اللثة الإنسان الكيراتينية 20 والحمض النووي من التلف في اللثة واللب خلايا الليفية 21.
واقترح منهجيات مختلفة للتحقيق في توافق مع الحياة من المواد المركبة الأسنان. تبقى المقايسات اللونية، التي تنطوي على تلوينات محددة وقياسات امتصاص الضوء، والأكثر شيوعا، نظرا لبساطتها النسبية والتكلفة المنخفضة 22- 26. التحليل المجهري على النقيض من ذلك الضوء في كثير من الأحيان يستهلك المزيد من الوقت وتتحمل تكاليف أعلى. ومع ذلك، هذه التقنيات المجهري لديها بعض المزايا الهامة. مراقبة هيكل الخلية تعطي معلومات موسعة حول الآثار السامة من ذوي الخبرة، وبالتالي توفير المزيد من البيانات ذات الصلة والحساسة. على وجه الخصوص، وقد سمح إدخال المجهري متحد البؤر 27 لمراقبة الهياكل البيولوجية مع تحسين دقة المحوري مقارنة واسعة المجال المجاهر مضان التصوير التقليدية. وبالتالي، أصبح التصوير متحد البؤر أداة تحقيق قوية في مختلف مجالاتالبحوث الطبية والعلمية. وعلى النقيض من تقنيات المجهر الإلكتروني والمسح الضوئي المجهري متحد البؤر يوفر القدرة على تصور مكونات متميزة من الخلايا عن طريق إدراج علامات الفلورسنت محددة. معظم هذه استشفاف محددة هي مستقر في البيئة المائية، يمكن قياسه بشكل معقول وغير مكلفة وغير سامة 28، مما يتيح استخدامها في السريرية وكذلك البحوث والدراسات المخبرية. وعلاوة على ذلك، وتجفيف العينات والتثبيت اللازمة لتحليل المجهر الإلكتروني التقليدية ليست ضرورية للمضي وقت التصوير متحد البؤر، وبالتالي الاستحواذ التي تعتمد على الوقت من الممكن أيضا على عينات. مقارنة مع التصوير ثنائي الأبعاد، ومبدأ التصوير متحد البؤر تمكن التصور العينة الجوفية وإعادة هيكل ثلاثي الأبعاد من مختلف الصور التي تم الحصول عليها العمق. الذي يترتب عليه، أكثر دقة وأكثر هيكلية التفاصيل 29، 30. الدراسة الحالية الفيديو هو مثال على استخدام ثلاثي الأبعاد الوقت الفاصل بين Confocal الليزر الضوئي المجهري (3D-CLSM) جنبا إلى جنب مع لايف / وضع العلامات الفلورية الميت وإشارة الكمي كطريقة مبتكرة. هذه التقنية المقدمة في هذه الورقة لديه ميزة تمكين التقييم والوقت الفاصل بين التصوير من حساسية الخلايا الحية دون تغيير بنية الخلية المقررة. ليس هناك حاجة لخطوات التحضير قبل تحليل متحد البؤر. سابقا، تم استخدام نفس تلطيخ لتقييم جدوى مثقف النوى عظم إسفنجي 31 ولكن من دون متحد البؤر الوقت الفاصل التالية. وبالمثل تم استخدام نفس الإجراء الوقت الفاصل بين متحد البؤر لتقييم النشاط الاريثروميسين الوقت القتل في البكتيريا من الحمأة المنشطة وفقا لمن نوع 32 غرام باستخدام بكتيريا محددة لايف / تلطيخ ميت. وقد تكيفت هذه الطرق مؤخرا واستخدمت لمقارنة سمية المركبة الأسنان على أساس أحادية ميتاكريليت 11.
سلوك المواد توافق مع الحياة هو المعلمة الأكثر مسبق ليتم تقييمها قبل الاستعمال الطبي. تغطي المعايير الدولية الأجهزة الطبية ISO 10993 33 وتحديدا مواد طب الأسنان ISO 7405 34. إن عدم وجود آثار سامة على الخلايا المحيطة هو القاعدة الرئيسية في تقييم توافق مع الحياة من هذه المواد. هذا هو السبب في اختبار السمية الخلوية لديه مثل هذه الأهمية في تقييم مواد طب الأسنان التوافق الحيوي 35-37. اقترح ISO يمكن أن تستند طرق الاختبار على النشاط الأيضي أو سلامة الغشاء. يجب النهاية اختيار متابعة شروط محددة لترتيب الآثار السلبية الناجمة عن مادة الاختبار وذلك لتقليل الوقت وتكلفة المقايسات التقييم. الطريقة الحالية من التحقيق (3D الوقت متحد البؤر التصوير مرور) هو سلامة غشاء القائم. ويبدو تقييم السمية الخلوية عبر هذه نقطة النهاية لتكون علامة قيمة من خلية biocompatibility مع المواد المختبرة وأنه هو أيضا وافق ISO نقطة النهاية. في المختبر يتم تصميم اختبارات لتحديد كيفية تأثير عينة مادية نوع خلية معينة. وقد وصف MTT فحص اللونية في الأصل من قبل موسمان (1983) كوسيلة مفيدة لقياس سمية الخلايا في المختبر وتكاثر الخلايا. ويستند اختبار MTT على تحويل الملح نتروبلو إلى بلورات formazan من قبل خلايا نشطة، والذي يحدد نشاط الميتوكوندريا. وهذا يمكن أن تترجم بمعدل 38 الجدوى. وذكرت والمتعاونين غوبتا أن الاختبار الإنتقالي العسكري هو الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع لقياس السمية الخلوية من الراتنجات المركبة. كما استخدمت نازعة السكسينيك وردود الفوسفاتيز القلوية لنفس الغرض 39. ومع ذلك، لا يمكن أن تتبع الخلايا مصير ما يصل، لأن الفحص الإنتقالي العسكري يتطلب قتل الخلايا في كل نقطة زمنية القياس. من أجل مراقبة عن كثب سلوك الخلايا الملون في الدراسة الحالية، ديتم إجراء المراقبة مصحح من الخلايا الحية، وذلك بفضل لوقت التصوير مرور CLSM جنبا إلى جنب مع تلطيخ بروتوكول القصير، تحليل الصور آليا والكمي إشارة الفلورسنت.
المركبة الأسنان تأتي في اتصال وثيق مع أنسجة الفم واللثة وخصوصا اللب الخلايا. أن الخلايا الليفية يكون الهدف من مكونات صدر من هذه المركبات التصالحية 40-41. وعلاوة على ذلك، فقد ذكرت العديد من الدراسات أن الخلايا خلد والخلايا الأولية قد تكون الاستجابات الخلوية المختلفة في اتصال مع المواد الحيوية. تم العثور على الخلايا الأولية لتكون أكثر ملاءمة لتقييم آثار المواد الحيوية 42. هذا ما يفسر استخدام الخلايا الليفية اللثة الإنسان الأساسية كنموذج خلية لتقييم السمية الخلوية للمركب الأسنان اختبرت في الدراسة الحالية. وقد درس على نطاق واسع احتمال سمية المواد التي تطلق من مركب الأسنان 43-44. من أجل تقييم رانه السامة المحتملة من المواد، ويمكن أن يؤديها خلايا نموذج الاتصال اثنين. في نظام نموذجي اتصال مباشر يتم وضع المواد مباشرة مع الخلايا المستهدفة بينما في نظام الاتصال غير المباشر، استهداف الخلايا هي على اتصال مع elutes من وسائل الاعلام البيولوجي. في التطبيقات السريرية والإجراءات التصالحية، وتوضع حشوة ضوئية على اتصال غير مباشر مع أنسجة اللثة. لهذا السبب، كان يركز البروتوكول التجريبي الحالي على نظام اتصال غير مباشر مع الخلايا الليفية الإنسان اللثة (خلايا بحضور مقتطفات مركبة اختبار). كما ذكرت سابقا دال والمتعاونين، كانت في المرتبة استجابات شديدة السمية الخلوية مثل (<30٪)، متوسطة (30-60٪)، خفيف (60-90٪) أو غير السامة للخلايا (> 90٪) على أساس النشاط النسبي ل القيم التي تم الحصول عليها لضوابط 45. وبالتالي، وفقا لهذا الترتيب، وفي ضوء النتائج التي تم الحصول عليها (الجدول 1)، يمكن أن يكون في المرتبة مركب ELS انكماش منخفض خارج كما الاصدارذ السامة للخلايا قليلا، وأظهر سلوك مماثل للسيطرة على الخلايا خلال فترة الفاصل الزمني بأكملها. باستخدام نفس الطريقة بالضبط التحقيق، يمكن مقارنة نتائج هذه الدراسة إلى أن من دراسة نشرت مؤخرا. أظهر ELS إضافية منخفضة انكماش مركب توافق مع الحياة متفوقة مقارنة مع اثنين من اختبار المركبة المستخدمة سابقا لنفس التطبيق السريري الذي هو استعادة مباشرة 11. دراسات أخرى لا تزال ضرورية لإقامة المقارنة أكثر اكتمالا.
عند البت فيها فحص السمية الخلوية للموافقة على إجراء تقييم نقطة نهاية محددة، فإنه من المهم فهم مزايا وحدود كل فحص. الغرض الرئيسي من التصوير متحد البؤر هو تحقيق العمارة 3-D من الخلايا والأعضاء. هذه التقنية قادرة على كشف ليس فقط سطح العينة، ولكن أيضا تحت السطحية لها. بروتوكول الموصوفة هنا يؤكد استخدام 3D CLSM وقت التصوير مرور متحد البؤر، كما سينسيطريقة موانع لتقييم السلوك توافق مع الحياة في المختبر من مركب الأسنان. ومع ذلك، من أجل تجنب القيود التي واجهتها في هذا العمل، يمكن أن تستخدم محطات العمل المضادة للاهتزاز وذلك للسماح أكثر استقرارا وأطول وقت التصوير مرور. الطاولة يمكن عزل نظام متحد البؤر المستخدمة من الآثار الضارة التي الاهتزازات في المختبر قد يسبب. وعلاوة على ذلك، ومواد لاستخدامها في جوف الفم يجب أن يكون مثاليا غير ضارة للأنسجة اللثة ويجب أن لا تحتوي على المواد التي يمكن أن تسبب سمية جهازية. وفقا للمنهجية المتبعة والنتائج المتحصل عليها من هذه الدراسة يمكن استنتاج أن مركب اختبار (ELS انكماش منخفض خارج) لا السامة للخلايا في الظروف التجريبية الحالية. كما أن طريقة CLSM يمكن أن تعطي بحساسية معدل الأولي للخلايا قابلة للحياة، يمكن أن يتوقع احتمالات أخرى لتقييم نقاط نهاية أخرى. على وجه الخصوص، كما أفيد مؤخرا أن تؤثر على الخلايا أحادية المركبة عبتيough أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 46- 48، هناك حاجة إلى إجراء مزيد من التحقيقات لتقييم الارتباطات إن وجدت بين السمية الخلوية وشبكات إنتاج ROS الإشارة. ويمكن تصميم البروتوكول المقبل لتقييم الانتاج في وقت واحد ريوس (H 2 O 2 و / أو O 2 – تلوين) ونسبة السمية الخلوية (لايف / تلطيخ الميت) باستخدام التصوير مرور الوقت CLSM.
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |