This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.
Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.
Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes5. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions6. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.
Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques7-9.
The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.
De luciferase-gebaseerde strategie beschreven is, een aantal voordelen boven andere bestaande werkwijzen waaronder het eenvoudige, snelheid, minimale uitrusting nodig en relatief lage kosten. Een belangrijke bijdrage aan deze is het vermijden van een seriële verdunning stap. Toch seriële verdunning gebaseerde derivaten van dit protocol zijn zeker haalbaar en werden onlangs gebruikt om luciferase uitdrukken Ebola titers beoordelen in een high-throughput antivirale scherm 11. Terwijl inherent tijdrovend en duurder, kunnen dergelijke aanpassingen groter dynamisch bereik voor virale kwantificering indien nodig. Naast de bijzonder geschikt voor de evaluatie van virale titers in de context van high-throughput screens, onze eentraps luciferase gebaseerde virale kwantificeringsmethode genereert nauwkeurige schattingen van infectieuze virions bij replicerende virussen. Bovendien uitlezingen van luminescentie naast cytotoxiciteit gegevens van hetzelfde experiment geven eenvolledig beeld van het effect van de experimentele voorwaarden doelcellen, hetgeen bijzonder nuttig in de context van oncolytische virussen en drugsgebruik schermen.
De hier getoonde voorbeeld wordt een negatieve replicerende enkelstrengs RNA-virus; echter kan dit protocol worden aangepast om een aantal replicerende en niet-replicerende virussen met enkele kleine aanpassingen protocol. Dit omvat DNA-virussen zoals Vaccinia, HSV en AAV (zie figuur 5). Monsters geïnfecteerd met intracellulaire virussen zoals vacciniavirus vereisen bijvoorbeeld een virus afgifte stap voor kwantificering (bijvoorbeeld ten minste een vries-dooi cyclus). Bij toepassing van deze techniek op andere virussen, moet de incubatietijd optimaliseren van de overdracht van het virale lysaat supernatant of het lezen van de platen door de luminometer. Deze parameter zal voornamelijk afhangen van de replicatiecyclus van het virus in de tolerante cellijn en de sterkte van de promoter rijden luciferase expressie. Dit kan het beste met de volledige standaard curve in de optimalisatie stap. Daarvoor moet men de geschikte permissieve cellijn met verschillende monsters van het bereide standaardkromme infecteren en lees elk repliceren op een andere tijdstippen na overdracht. Idealiter wordt een incubatietijd punt gekozen, dat leidt tot een lineair verband tussen LOG (RLU) en LOG (titer) verspreid over de verwachte monster titer bereik. Voor VSVΔ51-Fluc deze bedraagt typisch 10 4 pfu / ml -10 7 pfu / ml gedurende 5 uur incubatietijd. Bij lagere of hogere titers worden verwacht van monsters, kan men eenvoudig verhogen respectievelijk verlagen de incubatietijd. Alternatief kan monsters verdund binnen het bereik veel wordt typisch gedaan ELISA vallen.
Zoals hierboven vermeld, is deze methode zeer geschikt voor high-throughput drug screens middels drug bibliotheken meeste stappen worden automatisch uitgevoerd. Cellen worden uitgeplaat efficiently toepassing van een geautomatiseerde microplaat dispenser, kan de geneesmiddelenbibliotheek toevoegen via een 96-kanaals vloeistofmanipulator, kan virus worden toegevoegd met behulp van een microplaat dispenser en borden lezen met een geautomatiseerde luminometer. In principe kan deze ook worden aangepast aan 384 putjes of kleinere formaten; echter, de beperking tot dit einde is het aantal cellen die kunnen worden verzilverd, krijgen minder cellen leidt tot een kleiner bereik in de lineariteit van het LOG (RLU) tot (titer) relatie LOG. Tenslotte kan beoordeling van cellevensvatbaarheid met resazurin of andere metabole kleurstoffen gemakkelijk worden opgenomen in de workflow, waardoor discriminatie cytotoxische verbindingen antivirale schermen of identificatie van verbindingen die leiden tot synergistische doden in combinatie met virussen 12. Toch beperkingen van deze werkwijze omvatten het vereiste van een luciferase transgen virus, wat niet altijd mogelijk is, en de beschikbaarheid van voldoende permissieve cellijn. Het is echter waarschijnlijk mogelijk aanpassende werkwijze voor gebruik met andere reporter genen (bijvoorbeeld GFP) verstrekte de reporter kwantificeringsmethode een geschikte lineariteit en signaal-ruisverhouding. Kortom, kan de beschreven high-throughput werkwijze worden gemodificeerd om verschillende virussen aangepast en afgestemd op diverse toepassingen.
The authors have nothing to disclose.
Vanessa Garcia is funded by a Queen Elizabeth II Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology and Cory Batenchuk by a Natural Sciences and Engineering Research Council fellowship.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1mM solution, pH 7.3 |
alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96 well plate |
Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |