We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Cáncer epitelial de ovario es la neoplasia ginecológica más letal en los Estados Unidos. A pesar de que los pacientes responden inicialmente al tratamiento de referencia actual que consiste en una cirugía de citorreducción y quimioterapia de combinación que consiste en compuestos de platino y taxanos, casi el 90% de los pacientes se repita dentro de unos pocos años. En estos pacientes el desarrollo de la enfermedad quimiorresistente limita la eficacia de los agentes quimioterapéuticos actualmente disponibles y por lo tanto contribuye a la alta mortalidad. Para descubrir nuevas opciones de tratamiento que pueden dirigirse enfermedad recurrente, se requieren modelos animales adecuados que imitan de cerca el perfil clínico de los pacientes con cáncer de ovario recurrente. El reto en el seguimiento (ip) enfermedad intra-peritoneal limita el uso de modelos de IP y por lo tanto por vía subcutánea se establecen la mayoría de los xenoinjertos. Hemos desarrollado una plataforma de imagen óptico sensible que permite la detección y la localización anatómica de la masa tumoral ip. La plataforma incluye la uSE de reporteros ópticas que se extienden desde el rango de luz visible hasta el infrarrojo cercano, que en combinación con rayos X co-registro 2-dimensional puede proporcionar localización anatómica de señales moleculares. La detección se mejoró significativamente por el uso de un sistema de rotación que acciona el animal para múltiples posiciones angulares para formación de imágenes de 360 grados, lo que permite la identificación de tumores que no son visibles en la orientación individual. Esta plataforma proporciona un modelo único para el crecimiento del tumor monitor de forma no invasiva y evaluar la eficacia de nuevas terapias para la prevención o el tratamiento de cáncer de ovario recurrente.
Los modelos animales son herramientas indispensables en la investigación de ciencias de la vida. En el cáncer en particular, los datos obtenidos a partir de estudios en animales proporcionan la información necesaria para iniciar el ensayo de nuevas aplicaciones diagnósticas o terapéuticas en humanos 1-3. Los modelos animales de cánceres sólidos se establecen clásicamente por vía subcutánea, ya que proporciona un medio fácil de medir la carga tumoral y evaluar la eficacia del tratamiento sin tener que sacrificar a los animales. De hecho, los modelos intra-peritoneal (ip) requieren que los animales se sacrificaron para detectar y medir cualquier cambio en el crecimiento del tumor. Sin embargo, para los cánceres de IP tales cáncer de ovario, los modelos ortótropos ofrecen la ventaja de estudiar la enfermedad en su entorno adecuado 4-6. Para un modelo de este tipo que sea de utilidad en la evaluación de la actividad antitumoral, métodos de imagen no invasivos deben ser desarrollados que permiten la cuantificación de la carga tumoral ip en ratones vivos.
Un reto importante en lael uso de modelos animales ip es la dificultad de cuantificar con precisión la carga tumoral mediante un examen físico. La cuantificación precisa de los tumores de propiedad intelectual por lo general requieren que los ratones que ser sacrificado para la disección. Este enfoque requiere el uso de gran número de animales, que se sacrificó a diferentes puntos de tiempo. Además del costo, que introduce alta variabilidad de los datos debido a las variaciones inherentes dentro de cada animal. No invasiva tr la imagen óptica in vivo proporciona un enfoque más apropiado para monitorear la carga tumoral ip en ratones vivos.
Varios métodos de imagen no invasivas se utilizan actualmente en la investigación pre-clínica para el seguimiento del crecimiento del tumor y las respuestas terapéuticas. Estos incluyen la tomografía computarizada (CT), ultrasonido (US), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET), y formación de imágenes ópticas tales como la fluorescencia y bioluminiscencia 7-12. CT es un proceso de formación de imágenes que combina la transmisión de rayos X y computtecnología er. Se produce una imagen de sección transversal de los haces detectados de fotones de alta energía, que pasa a través del cuerpo con diferente velocidad. Estados Unidos es un tipo de imagen de reflexión, que envía sonidos de alta frecuencia al cuerpo creando ondas sonoras que se reflejan con diferente velocidad dependiendo de la densidad del tejido y reconocido por la computadora para producir una imagen visual de. MRI y PET son modalidades de imágenes de emisión que utilizan energía magnética y las partículas nucleares, respectivamente para producir la imagen. MRI crea un fuerte campo magnético que induce a las células a producir sus propias frecuencias de radio, que se utilizan para crear una imagen mientras PET requiere una cámara sensible para detectar la radiactividad de la etiqueta 7,9,11 2-fluorodeoxy-D-glucosa administrada. Finalmente, la imagen óptica se basa en la detección de la luz de emisión de reporteros o sondas 9,12 bioluminiscentes o fluorescentes.
En este reporte se describe el uso de la fluorescencia, que ofrecealgunas ventajas sobre los otros tipos de modalidades de imágenes. Con imágenes de fluorescencia, las células pueden ser genéticamente modificado para expresar proteínas fluorescentes constantemente sin requerir la adición de un sustrato o sondas a base de ligación, que son requisito para la bioluminiscencia y la resonancia magnética, respectivamente. Reporteros de fluorescencia también expresan típicamente una señal más brillante permitiendo así el uso de un método de detección menos sensible 8,12. Además, con imágenes de fluorescencia, es posible detectar tumores menores de 1 cm, que no es alcanzable con CT 7-9. Finalmente, en contraste con la bioluminiscencia, la señal de fluorescencia no requiere un ambiente aeróbico y por lo tanto la señal no está limitada en entornos hipóxicos, que por lo general se están produciendo en los núcleos de grandes tumores 13.
Sin embargo, como cualquier otra tecnología, métodos de imagen basados fluorescentes tienen sus desventajas. Una de ellas es la incapacidad de la machifotones de baja energía NE-generado para penetrar a una profundidad suficiente. Por lo tanto, para reducir al mínimo la cantidad de fotones de tejidos difusos los animales deben ser reflejados en diferentes ángulos. Se describe un protocolo para establecer un cáncer de ovario ip en ratones desnudos y un enfoque para el seguimiento de tumores ip que proporciona imágenes de los animales a través de toda la rotación. El rotador ángulos el ratón para posiciones específicas y repetibles que disminuye la interferencia tejido que a menudo se produce entre la fuente de luz y el detector. Esto optimiza la visualización de tumores más pequeños que de otra manera se perderían.
Se describe un protocolo para establecer un modelo animal de cáncer de ovario humano ip que imita el perfil clínico observado en los pacientes. Además, se describe el uso de un dispositivo de rotación animal que se refiere a la limitación de la sensibilidad de las imágenes 2D. Tomados en conjunto, estas técnicas pueden servir como plataformas para descubrir nuevos compuestos que pueden dirigirse cáncer de ovario recurrente quimiorresistentes. Además, dicho modelo se puede utilizar para comprender la biología de recurrencia y progresión del cáncer.
Debido a su localización retroperitoneal, en etapa temprana ip xenoinjertos de cáncer de ovario son casi imposibles de detectar mediante el examen físico el ratón. En la mayoría de los casos, una vez que la enfermedad se puede palpar, la carga tumoral ya es significativo y por lo tanto limita la evaluación de la eficacia del tratamiento. El uso de células marcadas fluorescentemente nos permite evaluar la fijación de tumor ip en tiempo real y por lo tanto identificar el momento óptimo para comenzar tratamiento. De manera similar, los xenoinjertos marcados con fluorescencia permiten el seguimiento de la respuesta al tratamiento. Cabe señalar sin embargo, que-ip tumores más profundos de 1 cm típicamente no son detectables independientemente del sistema reportero.
El uso de células madre humanas de cáncer de ovario 14,15,17,22 genera xenoinjertos que imitan el perfil clínico observado en pacientes. Como una enfermedad primaria, el modelo es sensible a Paclitaxel pero la interrupción del tratamiento con el tiempo conduce a la enfermedad recurrente quimiorresistente. La introducción de las células a través de los cuernos uterinos en la densidad especificada en la sección Protocolo por lo general resulta en tumores ováricos dentro de 10 días con un par de implantes peritoneales, y por lo tanto imita la enfermedad en estadio temprano. El uso de células marcadas fluorescentemente nos permite evaluar la fijación de tumor ip en tiempo real y por lo tanto identificar el momento óptimo para comenzar el tratamiento. De manera similar, los xenoinjertos marcados con fluorescencia permiten el seguimiento of respuesta al tratamiento. Si se utilizan otros tipos de líneas celulares de cáncer, de ovario o de otra manera, es posible que este perfil no se puede observar. Cuando SKOV3 se utiliza, por ejemplo, se ha informado de que los tumores iniciales IP ya son resistentes 23. Sin embargo, si marcado con un informador tal como fluorescencia, ip, la enfermedad se puede seguir en tiempo real.
Si se utiliza otro indicador fluorescente, es importante para realizar las imágenes inicial con un control (sin tumor) animal. Esto permitirá la optimización del protocolo de imagen para lograr el mejor fondo para señalar la relación. En nuestra experiencia, los ratones desnudos suelen tener alta de fondo cuando fotografiado usando los ajustes de adquisición de las buenas prácticas agrarias.
Es importante que las células inyectadas intrauterino están en suspensión única para evitar el establecimiento de los tumores en el útero. También es importante para evitar rayar la capa epitelial del útero, lo que también facilita el injerto de la célula cancerosas en el útero produciendo así un tumor intra-uterino en lugar de una enfermedad ip. Además, durante el análisis de datos, es importante para establecer el valor gamma a 1. Esto asegura que la intensidad de las imágenes es lineal y permite la comparación entre las imágenes.
Durante la adquisición de imágenes de Marte, es importante asegurarse de que el extremo entubado de la ojiva es plegable en el rebaje ojiva. La ojiva sirve como un punto de contacto para el ratón, por lo que se requiere para la obtención de ángulos calibrados con precisión. Para los protocolos de formación de imágenes más largos (es decir, más de 1 hora), se inyecta por vía subcutánea 100 l de solución salina estéril para ayudar a prevenir la deshidratación. La temperatura del cuerpo animal debe ser mantenida usando aire caliente fluyó a través del sistema a aproximadamente 37 ° C. Una limitación del sistema MARS es que sólo un animal se pueden obtener imágenes a la vez con un tiempo total de aproximadamente 1 hora por animal.
En conclusión, se describe la establishment de un modelo animal que imita estrechamente el cáncer de ovario, tanto la enfermedad primaria y recurrente. Este modelo se puede utilizar para evaluar la eficacia de las modalidades de diagnóstico o terapéuticos.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH RO1CA118678 y RO1CA127913, por la Fundación de la Familia Sands, y el descubrimiento para curar Programa.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |