We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Epithelialen Ovarialkarzinom ist die tödlichste gynäkologischen Malignomen in den Vereinigten Staaten. Obwohl die Patienten zunächst auf die aktuelle Standardtherapie bestehend aus chirurgischen debulking und Kombinationschemotherapie bestehend aus Platin und Taxan-Verbindungen reagieren, fast 90% der Patienten wiederkehren in ein paar Jahren. Bei diesen Patienten ist die Entwicklung von chemoresistenten Krankheits begrenzt die Wirksamkeit der derzeit verfügbaren Chemotherapien und trägt zu der hohen Mortalität daher. Um neue Therapiemöglichkeiten, die wiederkehrende Krankheit zielen können entdecken, werden geeignete Tiermodelle, die das klinische Profil von Patienten mit rezidivierendem Ovarialkarzinom genau imitieren erforderlich. Die Herausforderung bei der Überwachung intraperitoneale (ip) Krankheit schränkt die Verwendung von IP-Modelle und damit die meisten Heterotransplantate etabliert werden subkutan. Wir haben eine empfindliche optische Bildgebungsplattform, die den Nachweis und die anatomische Lage der ip Tumormasse ermöglicht. Die Plattform umfasst die use optischer Reporter, die aus dem Bereich des sichtbaren Lichts bis zum nahen Infrarot, die in Kombination mit 2-dimensionaler Röntgen Coausrichtung anatomische Lage des Molekularsignale erstrecken. Detektions signifikant durch die Verwendung eines Drehsystems, das Tier, um mehrere Winkelpositionen für die 360-Grad-Bildgebung steuert, so dass die Identifizierung von Tumoren, die nicht in Einzel Orientierung sichtbar verbessert. Die Plattform bietet eine einzigartige Modellnichtinvasiv Monitor Tumorwachstum und die Bewertung der Wirksamkeit von neuen Therapien für die Prävention oder Behandlung von rezidivierendem Ovarialkarzinom.
Tiermodelle sind unverzichtbare Werkzeuge in der biowissenschaftlichen Forschung. Bei Krebs insbesondere aus tierexperimentellen Studien gewonnenen Daten stellen die erforderlichen Informationen, um das Testen von neuen diagnostischen oder therapeutischen Anwendungen beim Menschen 1-3 initiieren. Tiermodelle für soliden Tumoren sind klassisch eingerichtet subkutan, da es eine einfache Möglichkeit, um die Tumorlast messen und bewerten die Wirksamkeit der Behandlung, ohne die Tiere zu opfern bietet. Tatsächlich erfordern intraperitonealen (ip) Modellen, dass die Tiere getötet, um zu detektieren und zu messen Änderungen im Tumorwachstum werden. , Für IP Krebsarten wie Eierstockkrebs, bieten orthotrope Modelle jedoch den Vorteil des Studiums der Krankheit in ihrem richtige Umgebung 4-6. Für ein solches Modell zur Verwendung bei der Bewertung der Antitumor-Aktivität zu sein, müssen nicht invasive Bildgebungsverfahren entwickelt werden, die die Quantifizierung von ip Tumorlast in lebenden Mäusen ermöglichen.
Eine große Herausforderung in derVerwendung von IP-Tiermodellen ist die Schwierigkeit bei der genauen Quantifizierung der Tumorbelastung durch körperliche Untersuchung. Genaue Quantifizierung von ip Tumoren erfordern in der Regel die Mäuse für die Präparation geopfert werden. Dieser Ansatz erfordert die Verwendung einer hohen Anzahl von Tieren, die zu verschiedenen Zeitpunkten geopfert werden würde. Zusätzlich zu den Kosten, stellt es eine hohe Variabilität der Daten durch die inhärenten Variationen innerhalb jedes Tier. Nicht-invasive in vivo optische Bildgebung bietet eine passendere Ansatz ip Tumorlast in lebenden Mäusen zu überwachen.
Mehrere nicht-invasiven bildgebenden Verfahren sind derzeit in der präklinischen Forschung zur Überwachung von Tumorwachstum und therapeutische Reaktionen verwendet. Diese umfassen Computertomographie (CT), Ultraschall (US), Magnetresonanztomographie (MRI), Positronenemissionstomographie (PET), und optische Bildgebung, wie Fluoreszenz und Biolumineszenz 7-12. CT ist ein Übertragungsabbildungsverfahren kombiniert Röntgen- und ComputER-Technologie. Es erzeugt ein Querschnittsbild des erfassten Strahlen energiereicher Photonen, die durch den Körper mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durchläuft. US ist eine Art Reflexionsbild, das Hochfrequenz-Töne an den Körper schaffen Schallwellen, die mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, je nach Gewebedichte und vom Computer erkannt, um ein sichtbares Bild zu erzeugen widerspiegeln sendet der. MRT und PET sind Emissionsbildgebungsmodalitäten, die magnetische Energie und nukleare Partikel zu verwenden, bzw. um das Bild zu erzeugen. MRT erzeugt ein starkes Magnetfeld, das Zellen induziert, um ihre eigenen Funkfrequenzen, die verwendet werden, um ein Bild zu erstellen produzieren, während PET erfordert eine empfindliche Kamera, um die Radioaktivität des administriert markierten 2-fluorodeoxy-D-Glucose 7,9,11 erkennen. Schließlich wird die optische Abbildung auf die Detektion des Emissionslichts von Biolumineszenz oder Fluoreszenz-Reportern oder Sonden 9,12 basiert.
In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung von Fluoreszenz, die bieteteinige Vorteile gegenüber anderen Arten von Bildgebungsmodalitäten. Mit Fluoreszenzabbildung können die Zellen gentechnisch verändert, um fluoreszierende Proteine exprimieren kontinuierlich, ohne dass die Zugabe eines Substrats oder Ligation basierende Sonden, die Bedingung für Biolumineszenz und Magnetresonanztomographie, sind jeweils sein. Fluoreszenz-Reporter exprimieren typischerweise auch ein helleres Signal somit die Verwendung einer weniger empfindlichen Nachweisverfahren 8,12 ermöglicht. Zusätzlich mit Fluoreszenzabbildung ist es möglich, Tumoren kleiner als 1 cm, die nicht erreichbar ist mit CT 7-9 zu erkennen. Schließlich, im Gegensatz zu Biolumineszenz, Fluoreszenz-Signal erfordert keine aeroben Umgebung und damit das Signal nicht in hypoxischen Umgebungen, die normalerweise in den Kernen von großen Tumoren auftreten, werden 13 begrenzt.
Als jede andere Technologie haben jedoch fluoreszenzbasierten Abbildungsverfahren Nachteile. Eines davon ist die Unfähigkeit des machine-generierten Photonen niedriger Energie auf eine ausreichende Tiefe zu durchdringen. Um somit die Menge des diffundierten Gewebe Photonen, sollten die Tiere in verschiedenen Winkeln abgebildet werden minimiert. Wir beschreiben ein Protokoll an eine IP Eierstockkrebs in Nacktmäusen und einen Ansatz für ip Tumorüberwachung, die gesamte Tierbildgebung bietet durch Rotation zu etablieren. Der Rotator Winkeln die Maus auf spezifischen und wiederholbaren Positionen Verringerung der Gewebestörungen, die oft zwischen der Lichtquelle und dem Detektor auftritt. Dies optimiert die Visualisierung von kleineren Tumoren, die sonst übersehen werden könnten.
Wir beschreiben ein Protokoll an eine IP menschlichen Eierstockkrebstiermodell, dass das klinische Profil bei Patienten beobachtet nachahmt etablieren. Ferner beschreiben wir die Verwendung eines Tieres Drehvorrichtung, die die Empfindlichkeit der Beschränkung der 2D-Bildgebung Adressen. Zusammengenommen können diese Techniken als Plattformen dienen, neue Verbindungen, die chemoresistenten rezidivierendem Ovarialkarzinom zielen kann entdecken. Darüber hinaus können solche Modell verwendet, um die Biologie von Rezidiv und Progression zu verstehen.
Aufgrund seiner retroperitonealen Lage sind im Frühstadium ip Eierstockkrebs Xenografts fast unmöglich, durch physisches Prüfung der Maus erkennen. In den meisten Fällen, wenn die Krankheit zu tasten, ist die Tumorbelastung bereits erhebliche und begrenzt die Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung damit. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Zellen ermöglicht es uns, die Einrichtung von IP-Tumor in Echtzeit und damit die Identifizierung der optimalen Zeit zu beginnen t beurteilenEHANDLUNG. In ähnlicher Weise, fluoreszenzmarkierten Xenografts ermöglichen Überwachung von Therapieansprechen. Es sollte darauf hingewiesen werden-out jedoch, dass IP-Tumoren tiefer als 1 cm sind typischerweise nicht nachweisbar ungeachtet des Reportersystems.
Die Verwendung von menschlichen Eierstockkrebsstammzellen 14,15,17,22 erzeugt Xenotransplantaten, die das klinische Profil in Patienten beobachtet imitieren. Als Primärerkrankung, ist das Modell in Reaktion auf Paclitaxel aber Absetzen der Behandlung führt schließlich zu chemoresistant Rezidiven. Die Einführung der Zellen durch die Gebärmutterhörner an der im Protokoll festgelegten Abschnitt Dichte führt in der Regel Ovarialtumoren innerhalb von 10 Tagen mit ein paar Bauch Implantate und damit ahmt Frühstadium der Krankheit. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Zellen ermöglicht es uns, die Einrichtung von IP-Tumor in Echtzeit zu identifizieren und folglich die optimale Zeit, um die Behandlung zu beginnen beurteilen. In ähnlicher Weise fluoreszenzmarkierten Xenotransplantate ermöglichen die Überwachung of Reaktion auf die Behandlung. Wenn andere Typen von Krebszelllinien verwendet werden, Eierstock- oder andernfalls ist es möglich, dass dieses Profil kann nicht beobachtet werden. Wenn SKOV3 wird verwendet, beispielsweise wurde berichtet, dass die Anfangs ip Tumoren sind bereits resistent 23. Wenn jedoch mit einem Reporter, wie Fluoreszenz, ip markiert Krankheit kann in Echtzeit verfolgt werden.
Wenn andere Fluoreszenzreporter verwendet wird, ist es wichtig, die ursprüngliche Abbildung mit einer Kontrolle (kein Tumor) Tier durchzuführen. Dies ermöglicht die Optimierung der Bildgebungsprotokoll, um die besten Hintergrund-Signal-Verhältnis zu erzielen. Nach unserer Erfahrung haben Nacktmäusen typischerweise hohen Hintergrund, wenn abgebildet mit den GFP Akquisition Einstellungen.
Es ist wichtig, dass die Zellen injiziert intrauterinen in Einzel Aussetzung die von Tumoren in den Uterus zu vermeiden. Es ist auch wichtig, um zu vermeiden Kratzer auf der Uterus Epithelschicht, die auch erleichtert Verpflanzung der Krebszelles in der Gebärmutter wodurch ein intrauterinen Tumor statt einer IP-Krankheit. Zusätzlich wird während der Datenanalyse ist es wichtig, den Gammawert auf 1. Dies stellt sicher, dass die Intensität der Bilder ist linear und ermöglicht den Vergleich zwischen den Bildern gesetzt.
Während der Erfassung der MARS-Bildern ist es wichtig, sicherzustellen, dass die verrohrt Ende des zusammenlegbaren Nasenkonus ist in der Vorsatzhaube Ausnehmung. Die Vorsatzhaube dient als Anlaufstelle für die Maus und ist daher für den Erhalt präzise kalibrierten Winkel erforderlich. Für längere Bildgebungsprotokolle (dh länger als 1 Stunde), injizieren 100 ul steriler Kochsalzlösung subkutan um zu verhindern Austrocknung. Tierkörpertemperatur sollte unter Verwendung von warmer Luft gehalten werden floß durch das System bei etwa 37 ° C. Eine Beschränkung des MARS-System ist, dass nur ein Tier auf einmal mit einer Gesamtlaufzeit von etwa 1 Stunde pro Tier abgebildet wird.
Abschließend beschreiben wir die establishment eines Tiermodells, das imitiert Eierstockkrebs, sowohl primäre als auch wiederkehrende Krankheit. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer Diagnose- oder Therapieverfahren zu bewerten.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde vom NIH Zuschüsse RO1CA118678 und RO1CA127913, die von der Sands Family Foundation, und die Entdeckung, um Programm zu heilen.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |