We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Câncer epitelial de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal nos Estados Unidos. Embora os doentes respondem inicialmente para o padrão actual de cuidados consistindo de citorredução cirúrgica e quimioterapia de combinação que consiste em compostos de platina e taxanos, quase 90% dos pacientes que se repetem dentro de poucos anos. Nestes pacientes o desenvolvimento da doença resistente à quimioterapia, limita a eficácia dos agentes de quimioterapia actualmente disponíveis e, por conseguinte, contribui para a elevada taxa de mortalidade. Para descobrir novas opções de tratamento que podem direcionar a doença recorrente, modelos animais apropriados que imitam de perto o perfil clínico dos pacientes com câncer de ovário recorrente são obrigatórios. O desafio na monitorização (ip) doença intra-peritoneal limita o uso de modelos ip e subcutânea, assim, a maioria dos xenoenxertos são estabelecidos. Nós desenvolvemos uma plataforma de imagem ótico sensível que permite a detecção e localização anatômica da massa tumoral ip. A plataforma inclui o usi de repórteres ópticas que se estendem a partir da gama de luz visível até perto do infravermelho, o que em combinação com 2-dimensional de raios X do co-registo pode fornecer a localização anatómica de sinais moleculares. A detecção pode ser significativamente melhorada pelo uso de um sistema de rotação que conduz o animal para várias posições angulares para imagiologia de 360 graus, permitindo a identificação de tumores que não são visíveis na orientação única. Esta plataforma apresenta um modelo único para o crescimento do tumor monitor de forma não invasiva e avaliar a eficácia de novas terapias para a prevenção ou tratamento de cancro do ovário recorrente.
Os modelos animais são ferramentas indispensáveis na pesquisa de ciências biológicas. No câncer particularmente, os dados adquiridos a partir de estudos com animais fornecem as informações necessárias para iniciar o teste de aplicações de diagnóstico ou terapêuticos em humanos 1-3. Modelos animais para tumores sólidos são classicamente estabelecida por via subcutânea, uma vez que fornece um meio fácil de medir a carga tumoral e avaliar a eficácia do tratamento sem ter que sacrificar os animais. De fato, os modelos intra-peritoneal (ip) exigem que os animais sejam sacrificados para detectar e medir as alterações no crescimento do tumor. No entanto, para cancros, tais ip cancro do ovário, modelos ortotrópicos oferecem a vantagem de se estudar a doença no seu próprio ambiente de 4-6. Para um tal modelo para ser de uso na avaliação da actividade anti-tumor, os métodos de imagem não-invasivos têm de ser desenvolvidas que permitem a quantificação da carga tumoral ip em ratos vivos.
Um grande desafio nauso de modelos animais IP é a dificuldade em quantificar com precisão a carga tumoral pelo exame físico. Quantificação precisa dos tumores ip normalmente exigem os ratos para ser sacrificado para dissecção. Esta abordagem requer a utilização de um elevado número de animais, o que poderia ser sacrificados em diferentes pontos de tempo. Em adição ao custo, que introduz a variabilidade dos dados elevado, devido a variações inerentes dentro de cada animal. Não-invasiva em imageamento óptico vivo fornece uma abordagem mais adequada para monitorar a carga tumoral ip em camundongos vivos.
Vários métodos de imagem não invasivos são atualmente utilizados em pesquisa pré-clínica para o acompanhamento do crescimento do tumor e respostas terapêuticas. Estes incluem a tomografia computadorizada (TC), ultra-sonografia (US), ressonância magnética (MRI), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e de imagem óptico, tais como fluorescência e bioluminescência 12/07. TC é um processo de transmissão de imagem combina raios-X e computtecnologia er. Ela produz uma imagem de corte transversal de feixes detectados de fotões de alta energia, que passa através do corpo com uma velocidade diferente. EUA é um tipo de imagem de reflexão, que envia sons de alta frequência para o corpo criando ondas sonoras que são refletidas com velocidade diferente dependendo da densidade do tecido e reconhecido pelo computador para produzir uma imagem visual de. Ressonância magnética e PET são modalidades de imagem de emissões que usam energia magnética e partículas nucleares, respectivamente para produzir a imagem. RM cria um forte campo magnético que induz as células a produzir os seus próprios frequências de rádio, os quais são usados para criar uma imagem, enquanto o PET requer uma câmara sensível para detectar a radioactividade do rotulado 7,9,11-2 fluorodeoxy-D-glicose administrada. Finalmente, imagiologia óptica baseia-se na detecção da emissão de luz de repórteres ou sondas fluorescentes ou 9,12 bioluminescentes.
Neste relatório, nós descrevemos o uso de fluorescência, que oferecealgumas vantagens sobre os outros tipos de modalidades de imagem. Com imagens de fluorescência, as células podem ser geneticamente modificadas para expressar proteínas fluorescentes constantemente sem exigir a adição de um substrato à base de sondas ou de ligação, que são necessários para a bioluminescência e ressonância magnética, respectivamente. Repórteres de fluorescência também expressam tipicamente um sinal brilhante permitindo assim a utilização de um método de detecção menos sensível 8,12. Além disso, com a imagem de fluorescência, é possível detectar tumores menores do que 1 cm, o que não é realizável com CT 7-9. Finalmente, em contraste com a bioluminescência, sinal de fluorescência não requer um ambiente aeróbico e, portanto, o sinal não é limitado em ambientes hipóxicos, que estão normalmente presentes nos núcleos de tumores grandes 13.
No entanto, como qualquer outra tecnologia, métodos de imagem baseados em fluorescente tem suas desvantagens. Uma delas é a incapacidade do machifótons de baixa energia gerada por ne para penetrar a uma profundidade suficiente. Assim, para minimizar a quantidade de fotões difusos dos tecidos dos animais deve ser fotografada em ângulos diferentes. Nós descrevemos um protocolo para estabelecer um câncer de ovário ip em camundongos nus e uma abordagem para monitoramento tumor ip que fornece imagens animal inteiro através da rotação. O rotador ângulos do rato para posições específicas e repetíveis diminuindo a interferência do tecido que ocorre frequentemente entre a fonte de luz e o detector. Isso otimiza a visualização de tumores menores, que podem passar despercebidos.
Nós descrevemos um protocolo para estabelecer um modelo animal ip humana câncer de ovário que imita o perfil clínico observado nos pacientes. Além disso, descreve-se a utilização de um dispositivo de rotação animal que aborda a limitação de sensibilidade de imagem 2D. Tomados em conjunto, estas técnicas podem servir como plataformas para descobrir novos compostos que podem direcionar o cancro do ovário recorrente resistente à quimioterapia. Além disso, esse modelo pode ser usado para entender a biologia da recidiva e progressão do cancro.
Devido à sua localização retroperitoneal, em estágio inicial ip xenotransplantes de câncer de ovário são quase impossíveis de detectar através do exame físico do mouse. Na maioria dos casos, uma vez que a doença pode ser palpado, a carga tumoral é já significativa e, por conseguinte, limita a avaliação da eficácia do tratamento. A utilização de células marcadas por fluorescência permite-nos avaliar o estabelecimento de tumor ip em tempo real e, consequentemente, identificar o tempo óptimo para começar tratamento. De um modo semelhante, xenoenxertos fluorescentes marcado permitir a monitorização da resposta ao tratamento. Deve salientar-ip, contudo, que os tumores mais profundo que 1 cm não são tipicamente detectáveis independentemente do sistema repórter.
A utilização de células estaminais humanas de cancro do ovário 14,15,17,22 gera xenoenxertos que imitam o perfil clínico observado em pacientes. Como uma doença primária, o modelo é sensível ao Paclitaxel, mas a cessação do tratamento, eventualmente, conduz a doença recorrente resistente à quimioterapia. Apresentando as células através dos cornos uterinos, na densidade especificada na seção Protocolo geralmente resulta em tumores de ovário dentro de 10 dias, com alguns implantes peritoniais e, portanto, imita a doença em estágio inicial. A utilização de células marcadas por fluorescência permite-nos avaliar o estabelecimento de tumor ip em tempo real e, consequentemente, identificar o tempo óptimo para começar o tratamento. De um modo semelhante, xenoenxertos fluorescentes marcado permitir o acompanhamentof resposta ao tratamento. Se forem utilizados outros tipos de linhas celulares de cancro, do ovário ou de outra forma, é possível que este perfil não pode ser observado. Quando SKOV3 é utilizada, por exemplo, tem sido relatado que os tumores iniciais ip já são resistentes 23. No entanto, se marcado com um repórter tal como fluorescência, ip, a doença pode ser seguido em tempo real.
Se outro repórter fluorescente é usado, é importante realizar imagem inicial com um controlo (nenhum tumor) dos animais. Isso permitirá a otimização do protocolo de imagem para atingir o melhor fundo para sinalizar a relação. Em nossa experiência, os camundongos nus normalmente têm alta de fundo quando fotografada usando as configurações de aquisição de GFP.
É importante que as células injectadas intra-uterino estão em suspensão única para evitar o estabelecimento de tumores no útero. É também importante para evitar riscar a camada epitelial do útero, o que também facilita o enxerto da célula cancerosas no útero, produzindo assim um tumor intra-uterina em vez de uma doença ip. Além disso, durante a análise de dados, é importante para definir o valor de gama para 1. Isso assegura que a intensidade das imagens é linear e permite a comparação entre as imagens.
Durante a aquisição de imagens MARS, é importante para garantir que a extremidade do cone de protecção, entubado é dobrável no recesso cone de protecção. O nosecone serve como um ponto de contato para o rato e, portanto, é necessário para a obtenção dos ângulos precisamente calibrados. Para protocolos de imagem mais longos (isto é, mais do que 1 hora), injectar 100 ul de solução salina estéril por via subcutânea para ajudar a prevenir a desidratação. A temperatura do corpo de animal deve ser mantida usando ar quente fluiu através do sistema a cerca de 37 ° C. Uma limitação do sistema MARS é que apenas um animal pode ser trabalhada ao mesmo tempo com um tempo total de funcionamento de cerca de 1 hora por animal.
Em conclusão, podemos descrever o establishment de um modelo animal que imita o câncer de ovário, tanto doença primária e recorrente. Este modelo pode ser utilizado para avaliar a eficácia de modalidades de diagnóstico ou terapêuticos.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi suportado por concessões do NIH RO1CA118678 e RO1CA127913, pela Fundação Família Sands, ea descoberta para curar Programa.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |