De aanwezigheid van hoog-risico HPV in het hoofd en de nek tumorweefsel wordt geassocieerd met gunstige resultaten. De recent ontwikkelde RNA in situ hybridisatie techniek genaamd RNAscope maakt een directe visualisatie van HPV E6/E7 mRNA in FFPE weefsel secties.
De 'gouden standaard' voor oncogene HPV-detectie is de demonstratie van transcriptionally actief hoog-risico HPV in tumorweefsel. Echter, detectie van E6/E7 mRNA door middel van kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie (qRT-PCR) vereist RNA-extractie die vernietigt het tumorweefsel context van cruciaal belang voor morfologische correlatie en is moeilijk in de dagelijkse klinische praktijk worden aangenomen. Het recent ontwikkelde RNA in situ hybridisatie technologie, RNAscope, maakt directe visualisatie van RNA in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel molecuul gevoeligheid en enkele cel resolutie, die zeer gevoelig en specifiek in situ analyse van elke RNA biomarker kunnen in routine klinische monsters. De RNAscope HPV-test werd ontworpen om de E6/E7 mRNA zeven hoog risico HPV-genotypen (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58) met een pool van genotype-specifieke probes detecteren. Het heeft een uitstekende gevoeligheid aangetoonden specificiteit tegen de huidige 'gouden standaard' methode voor het opsporen E6/E7 mRNA door qRT-PCR. HPV-status bepaald door RNAscope is sterk voorspellende van klinische resultaten bij orofaryngeale kankerpatiënten.
Hoog-risico humaan papillomavirus (HR-HPV) is goed voor ongeveer 5% van alle kanker wereldwijd 1. De incidentie van HPV-geassocieerde orofarynxcarcinoom is toegenomen in de afgelopen decennia, vooral bij mannen. HPV-positieve orofaryngeale plaveiselcelcarcinoom (OPSCC) zal waarschijnlijk een meerderheid van alle hoofd-en halskanker in de Verenigde Staten vormen in de komende 20 jaar 2. Orofaryngeale plaveiselcelcarcinomen veroorzaakt door HPV geassocieerd met gunstige overleving en status tumor HPV is een sterke en onafhankelijke prognostische factor voor overleving 3.
Bewijs voor transcriptionele activering van de virale oncogenen E6 en E7 wordt beschouwd als de gouden standaard voor de aanwezigheid van klinisch relevante HPV 4. Maar detectie van E6/E7 mRNA van verse tumorweefsel door RT-PCR techniek is niet praktisch in de dagelijkse klinische praktijk en is beperkt tot de onderzoekslaboratoria. Onlangs hebben we have ontwikkelde een nieuwe RNA ISH technologie genaamd RNAscope, die multiplex detectie mogelijk maakt in individuele cellen met een enkele RNA-molecuul gevoeligheid in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefselmonsters (FFPE) 5-10. Wij verzorgden drie lijnen van bewijs voor single molecule detectie 5. Ten eerste, de RNAscope probe-ontwerp en signaalamplificatiesysteem toegestaan detectie van enkele kopie HER2 genome DNA doelen in HeLa-en SK-BR-3-cellijnen. Ten tweede, in vergelijking met HER2 genomisch DNA signalen, de verdeling van de fluorescentie-intensiteiten van HER2 mRNA signaal stippen in HeLa-cellen was consistent met een molecuul per punt. Ten derde, het aantal HER2 mRNA signaal dots per cel nauw bij elkaar aan de HER2 mRNA kopie aantal geschat door een oplossing op basis van kwantificering assay, single molecule detectie verdere ondersteuning. Bovendien tegenkleuring van kernen met DAPI in fluorescentie microscopie of met hematoxyline in bright-field microscopie maakt visualisatie van de individuele kernen, which beurt maakt detectie en kwantificering van RNA doelen op een eencellige basis 10. De mogelijkheid om genexpressie te analyseren in situ in de routine klinische monsters maakt RNAscope een veelbelovend platform voor diagnostische pathologie, vooral die FFPE weefsel-sectie gebaseerde testen 10,11. We hebben een RNAscope-gebaseerde test HPV E6/E7 mRNA te detecteren zeven hoog risico HPV-genotypen (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58) met een pool van genotype-specifieke probes ontwikkeld. Onze recente studies hebben aangetoond dat OPSCC de RNAscope HPV-test is zeer gevoelig en specifiek het toekennen van HPV op FFPE weefsels 12-17, en ook informeert prognose OPSCC 12,16.
Het principe van de RNAscope technologie is eerder beschreven 5. We beschrijven hier de volledige RNAscope assayprotocol en demonstreren het gebruik ervan in de detectie van HR-HPV in FFPE tumorweefsel secties.
De RNAscope HPV test toegestaan directe visualisatie van E6/E7 mRNA in situ in HPV-geassocieerde hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. De RNAscope test is volledig compatibel met routinematig vaste tumorweefsel en behoudt weefselmorfologie voor histopathologisch correlaties (figuur 2). Een belangrijk voordeel van de RNAscope test ten opzichte van conventionele CISH methoden is dat het specifiek versterkt de hybridisatiesignalen (figuren 2B tr 2E) zonder het versterken van de achtergrond ruis (figuren 2C tr 2F).
In de praktijk kan de RNAscope HPV test procedure worden afgerond binnen 8 uur of handig verdeeld over twee dagen. De RNAscope HPV-test is gebruikt om HPV-status in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom 12-16 bepalen, waaruit 97% sensitiviteit en specificiteit van 93% met qRT-PCR als referentiemethode 16. Conventionele chromogenic ISH voor HR-HPV-DNA is zeer specifiek, maar heeft een sensitiviteit van ~ 80% 12. Immunohistochemische (IHC) kleuring voor de cellulaire surrogaatmarker p16 werd een uitstekende gevoeligheid, maar kan vals-positieve resultaten 15,18, vooral in nonoropharyngeal hoofd-halskanker 15 genereren. De huidige "gouden standaard" methode qRT-PCR voor HPV E6/E7 mRNA detectie vereist bevroren weefsel voor optimale resultaten en technisch complex, die het gebruik ervan beperkt tot alleen het onderzoekslaboratorium. Bovendien vereist RNA-extractie waardoor het onmogelijk HR-HPV E6/E7 mRNA correleert met histopathologie.
Er zijn verschillende kritische factoren voor het succes van de RNAscope assay. Eerste, voor de beste resultaten, weefsels moeten worden in vers 10% neutraal gebufferde formaline gefixeerde bij kamertemperatuur gedurende 16-32 uur volgens ASCO / CAP richtlijnen 19. Ten tweede wordt de HybEZ oven sterk aanbevolen omdat inschakelens optimale controle van temperatuur en vochtigheid voor probe hybridisatie en signaalversterking stappen. Ten derde is het belangrijk om overtollig resterende buffers verwijderen voor elke stap, maar nog steeds de weefselsectie van droging bij een van deze stappen.
De hier beschreven handmatige RNAscope procedure is volledig geautomatiseerd op commerciële dia auto-kleuring 10. Dit zou aanzienlijk vergemakkelijken standaardisatie van testomstandigheden en bespaart kostbare handenarbeid in klinische pathologie laboratoria. Daarnaast heeft speciale software voor beeldanalyse ontwikkeld 10 om de cellen en vlekken signalen op een gedigitaliseerde dia, die moeten helpen subjectiviteit te leggen en de reproduceerbaarheid noteren automatisch identificeren.
Samengevat, de RNAscope HPV-test detecteert de aanwezigheid van HR-HPV E6/E7 mRNA transcripten in situ in FFPE weefsels. Het heeft een workflow die vertrouwd is bij klinische pathologie laboratoriaTories doordat zij de direct visualisatie van deze in weefsel secties. Het biedt een ideaal platform voor de behandeling van (FFPE) weefselmonsters, en kan gemakkelijk door diagnostische pathologie laboratoria worden aangenomen.
The authors have nothing to disclose.
Mede ondersteund door NIH-subsidie (R43/44CA122444) en DOD BRCP subsidie (W81XWH-06-1-0682) naar YL.
SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||