Özet

에서 전기 생리학 기록<em> 초파리</em> Labellar는 Sensilla 맛

Published: February 26, 2014
doi:

Özet

이 프로토콜은 초파리에서 labellar 맛 뉴런에 의해 트리거되는 액션 잠재적 인 반응의 세포 녹음을 설명합니다.

Abstract

곤충의 주변 맛 응답 강력 전기 생리학 기술을 조사 할 수 있습니다. 여기에서 설명하는 방법은 연구자가 곤충 신경계는 환경에서 맛의 자극에서받는 감각 입력을 반영, 직접 정량적으로 미각 반응을 측정 할 수 있습니다. 이 프로토콜은이 기술을 수행하는 모든 주요 단계를 설명합니다. 등 필요한 장비 및 녹음에 적합한 환경의 선택과 같은 전기 생리학 장비를 조립에서 중요한 단계가 묘사되어있다. 우리는 또한 적절한 참조 및 기록 전극을 만들어 녹음을 준비하는 방법에 대해 설명하고, tastant 솔루션을 제공합니다. 우리는 상세히 코를 고정화하기 위해 플라이로 유리 기준 전극을 삽입하여 곤충의 제조에 사용되는 방법을 설명한다. 우리는 설탕과 쓴 화합물에 대한 응답으로 맛의 신경 세포에 의해 해고 전기 자극의 흔적을 보여줍니다. 프로토콜의 측면들은 t 아르으로 말하면 도전과 우리는 신호 또는 시스템의 과도한 소음의 부족, 그리고 잠재적 인 솔루션으로 발생할 수있는 몇 가지 일반적인 기술 과제의 광범위한 설명을 포함. 기술은 시간적으로 복잡한 자극을 전달 배달을 자극 직전에 발사 배경을 관찰하거나, 편리 불용성 맛 화합물을 사용할 수없는 등의 제한 사항이 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고, (프로토콜에서 참조하는 약간의 변동 사항을 포함한다)이 기술은 화합물을 맛 초파리 신경 세포의 반응을 기록 광범위하게 허용 절차 표준입니다.

Introduction

맛의 감각은 벌레가 녹는 화학 물질의 광대 한 범위를 감지 할 수 있으며 영양 물질의 수용에 중요한 역할, 또는 유해 독성 하나의 거절을한다. 맛도 페로몬 1-5의 검출을 통해, 친구 선택에 역할을하는 것으로 생각된다. 이 중요하고 다양한 기능 감각 시스템은 환경 신호를 관련 행동 출력으로 변환하는 방법에 곤충 맛 시스템 조사의 강력한 대상 만들었습니다.

초파리의 맛 시스템의 기본 단위는 맛 머리, 또는 sensillum입니다. 분자는 팁 2,6에서 기공을 통해 sensillum을 입력합니다. Sensilla는 labellum, 다리, 날개 마진 및 인두 6에서 찾을 수 있습니다. labellum에서 sensilla의 수와 위치는 틀​​에 박힌됩니다. 길이 (L), 중간 (I), 짧은 (S : 세 가지 형태의 길이에 따라 sensilla의 클래스가 있습니다 ) 7,8 sensilla. 각 sensillum 두 (I 형) 또는 4 개 (L-및 S-타입) 미각 수용체 뉴런 (GRNs) 9 중 하나가 포함되어 있습니다. 다른 GRNs 맛 자극의 서로 다른 카테고리에 응답 쓴, 설탕, 소금, 삼투압 7,10 및 미각 수용체 8,11-13의 다른 하위 집합을 표현한다. 만 I과 S-타입 sensilla 쓴 응답 GRNs 8,10가 포함되어 있습니다. subesophageal 신경절 (SOG)과 맛의 분자에 의해 자신의 활성화에 GRNs 프로젝트는 행동 반응 6 결과, 디코딩을위한 높은 중추 신경계로 전달된다. 뉴런의 상대적으로 적은 수의 분자 및 행동 분석에 복종 할 의무가 초파리의 맛 시스템 일반적으로 미각 시스템의 조사를위한 훌륭한 모델을합니다. 시스템이 유전 적 돌연변이 또는 GAL4-UAS 발현 시스템을 통해 조작 될 수있는 상대적 용이성은 또한 유용한 도구 14,15로서 기능한다.

이러한 sensilla가 labellum의 표면으로부터 돌출되어 있기 때문에 "ontent> 이들은 전기 생리학에 대한 우수한 표적을 만든다. GRNs의 소성은 세포 외 기록을 사용하여 모니터링 할 수있다. 역사적 삽입 유리 전극을 사용하여 측벽 기록 방법, sensillum 신경 활성을 기록하는, (26)이 사용되었다. 그러나,이 방법을 실시 할 기술적 도전과 롱 각 제제로부터 대해 기록하는 것이 곤란하다. 전극과 뉴런의 응답을 측정 팁 기록 방법, 즉 동시에 tastant을 제공, 이후 선택 9,16의 방법이되고있다. 그것은 초파리 8,10,17,18의 맛 시스템뿐만 아니라 다른 곤충 종의 19 ~ 23의 숫자를 조사하기 위해 활용되고 있습니다. 그것은이 크게 보상하여 팁 기록 방법의 주요 단점 중 하나를 극복 tastePROBE 증폭기의 개발에 의해 촉진 된GRN의 활동 전위가 과도한 증폭 또는 필터링 (24)없이 기록 할 수 있도록 상기 기준 전극 및 곤충 sensillum간에 큰 전위차. 또 다른 중요한 발전은 기록 전해질 (25) 등 tricholine 구연산을 사용했다. TCC는 삼투압에 민감한 GRN에서 반응을 억제하고 25 분석 훨씬 쉽게 쓴 설탕 tastants에 의해 생성 된 응답을하고, 소금에 민감한 GRN를 자극하지 않습니다.

여기에서 우리는 초파리 labellar의 sensilla의 팁 녹화가 현재 칼슨 실험실에서 수행되는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 전기 생리학 방법 비행을 준비하는 장비, 방법과 맛 녹음을 수행하는 방법을 설정하는 방법에 대해 설명합니다. 이 작업을 사용하는 경우 우리는 또한 초파리 sensilla의 하위 집합뿐만 아니라, 몇 가지 일반적인 문제와 발생할 수있는 잠재적 인 솔루션에서 기록하여 얻은 몇 가지 대표적인 데이터를 제공기술.

Protocol

다음 프로토콜은 예일 대학의 모든 동물 보호 지침을 준수합니다. 1. 시약 및 장비 제조 녹화 장비 설치 (그림 1A). 온도 나 습도에 큰 변화의 무료 또한 냉장고, 원심 분리기 등의 전기 및 기계 소음의 원인으로부터 격리 장비 설치를위한 공간을 선택합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51355/51…

Representative Results

그림 (a)는 설탕, 자당 L의 sensillum의 반응을 보여줍니다. 같은 sensillum가 쓴 화합물에 반응하지 않는, 베르베린. 그림 (b)는 쓴 반응 신경 세포를 포함하는 I 형 sensillum는, 베르베린에 대한 응답으로 큰 진폭 스파이크, 자당에 대한 응답으로 작은 진폭 스파이크를 표시 것을 보여줍니다. 내가 TCC 사실상 응답 (그림 5)를 표시하지 sensilla 동안 L은, 용매 제어, TCC에 ?…

Discussion

Labellar sensilla 인해 형태와 해부학 적 조직의 차이에 따라 기록의 용이성에 따라 다릅니다. 때때로 sensillum은 어떤 tastants에 긍정적 인 반응을 유도하는 것으로 알려져 한 마리도 응답하지 않습니다. 이 문제가 발생하는 빈도는 sensillum 유형에 따라 달라집니다. L의 sensilla 가장 일관되게 응답하는 인해 자신의 길이에 접근하기가 비교적 쉽다. 일반적으로, S의 sensilla는 지속적으로 반응하지만, 자신의…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 (RD에) NRSA predoctoral 부여 1F31DC012985에 의해 JC에 NIH 보조금에 의해 지원되었다

우리는 도움을 컴파일하는 인물에 대한 원고, 라이언 박사 요셉에 도움이 코멘트 박사 리니 와이즈에게 감사하고, 도움이 기술적 조언 박사 프레드릭 마리온 – 설문 조사 것이다. 우리는 또한 네 개의 검토의 도움 의견을 인정하고 싶습니다.

Materials

Stereo Zoom Microscope Olympus  SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand
Anti-vibration Table Kinetic Systems BenchMate2210
Micromanipulators Narishige NMN-21
Magnetic stands ENCO Model #625-0930
Reference Electrode Holder Harvard Apparatus ESP/W-F10N Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range
 Silver Wire World Precision Instruments AGW1510 0.3-0.5mm diameter
Retort Stand generic
Outlet Plastic Tube generic, 1cm diameter
Flexible Plastic Tubing Nalgene  8000-0060 VI grade 1/4 in internal diameter 
500 ml Conical Flask generic,  with side arm
Aquarium Pump Aquatic Gardens Airpump 2000
Fiber Optic Light Source Dolan-Jenner Industries Fiber-Lite 2100
White Card/Paper Whatman 1001-110
Digital Acquisition System Syntech IDAC-4 Alternative: National Instruments NI-6251  
Headstage Syntech DTP-1 Tasteprobe
Tasteprobe Amplifier Syntech DTP-1 Tasteprobe
Alligator Clips Grainger 1XWN7 Any brand is fine
Insulated Electrical Wire Generic
Gold Connector Pins World Precision Instruments 5482
Personal Computer Dell  Vostro Check for compatibility with digital acquisition system and software
Acquisition Software Syntech Autospike Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251
Aluminum Foil and/or Faraday Cage Electro-magnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Pipette Puller Sutter Instrument Company Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller
Beadle and Ephrussi Ringer Solution See recipe in protocol section
Tricholine citrate, 65%  Sigma T0252-100G
Stereo Microscope Olympus VMZ 1x-4x Capable of 10x-40x magnification
Ice Bucket Generic
p200 Pipette Tips Generic
Spinal Needle Terumo SN*2590
1ml Syringe Beckton-Dickenson 301025
Fly Aspirator Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay Generic
Forceps Fine Science Tools By Dumont 11252-00 #5SF (super-fine tips)
10ml Syringe  Beckton-Dickinson 301029
Plastic Tubing Tygon R-3603

Referanslar

  1. Glendinning, J. I., Jerud, A., Reinherz, A. T. The hungry caterpillar: an analysis of how carbohydrates stimulate feeding in Manduca sexta. The Journal of experimental biology. 210, 3054-3067 (2007).
  2. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139, 234-244 (2009).
  3. Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
  4. Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell reports. 1, 599-607 (2012).
  5. Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
  6. Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell and tissue research. 275, 3-26 (1994).
  7. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoological Science. 19, 1009-1018 (2002).
  8. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The Molecular and Cellular Basis of Bitter Taste in Drosophila. Neuron. 69, 258-272 (2011).
  9. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. Journal of Morphology. 150, 327-341 (1976).
  10. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 61, 333-342 (2004).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science (New York, N.Y.). 287, 1830-1834 (2000).
  12. Cameron, P., Hiroi, M., Ngai, J., Scott, K. The molecular basis for water taste in Drosophila. Nature. 465, 91-95 (2010).
  13. Croset, V., et al. Ancient protostome origin of chemosensory ionotropic glutamate receptors and the evolution of insect taste and olfaction. PLoS Genet. 6, e1001064 (2010).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development (Cambridge, England). 118, 401-415 (1993).
  15. Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nature genetics. 36, 288-292 (2004).
  16. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science (New York, N.Y.). 122, 417-418 (1955).
  17. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56, 503-516 (2007).
  18. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67, 555-561 (2010).
  19. Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45, 871-876 (1999).
  20. Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of “bitter” taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 7281-7287 (2002).
  21. Sanford, J. L., Shields, V. D., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Die Naturwissenschaften. 100, 269-273 (2013).
  22. Merivee, E., Must, A., Milius, M., Luik, A. Electrophysiological identification of the sugar cell in antennal taste sensilla of the predatory ground beetle Pterostichus aethiops. J Insect Physiol. 53, 377-384 (2007).
  23. Popescu, A., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. Journal of comparative physiology. A, Neuroethology. 199, 403-416 (2013).
  24. Marion-Poll, F., Der Pers, J. V. a. n. Un-filtered recordings from insect taste sensilla. Entomologia Experimentalis et Applicata. 80, 113-115 (1996).
  25. Wieczorek, H., Wolff, G. The labellar sugar receptor of Drosophila. J. Comp. Physiol. A. Neuroethol Sens. Neural Behav. Physiol. 164, 825-834 (1989).
  26. Morita, H. Initiation of spike potentials in contact chemosensory hairs of insects. III. D.C. stimulation and generator potential of labellar chemoreceptor of calliphora. Journal of cellular and comparative physiology. 54, 189-204 (1959).
  27. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2, e661 (2007).
  28. Benton, R., Dahanukar, A. Electrophysiological recording from Drosophila taste sensilla. Cold Spring Harbor protocols. 2011, 839-850 (2011).
  29. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , e1725 (2010).
  30. Axon Instruments. . The Axon Guide for Electrophysiology & Biophysics Laboratory Techniques. , (1993).
  31. Fujishiro, N., Kijima, H., Morita, H. Impulse frequency and action potential amplitude in labellar chemosensory neurones of Drosophila melanogaster. Journal of insect physiology. 30, 317-325 (1984).
  32. Marion-Poll, F., Tobin, T. R. Software filter for detecting spikes superimposed on a fluctuating baseline. Journal of neuroscience. 37, 1-6 (1991).
  33. Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem Senses. 28, 671-679 (2003).
  34. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. Journal of neurobiology. 56, 139-152 (2003).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla. J. Vis. Exp. (84), e51355, doi:10.3791/51355 (2014).

View Video