Proprioceptie en Tension Receptoren in Crab Ledematen: Student Laboratorium Oefeningen
Özet
Fysiologische en anatomische technieken worden gedemonstreerd aan functie en structuur voor gezamenlijke proprioceptoren en spierspanning receptoren in schaaldieren wandelen ledematen te pakken.
Abstract
Het primaire doel van deze procedures is voor onderwijs en onderzoek aan te tonen hoe de activiteit van levende primaire sensorische neuronen die verantwoordelijk zijn voor proprioceptie als ze detecteren gezamenlijke positie en beweging, en spierspanning te nemen. Elektrische activiteit van schaaldieren proprioceptoren en spanning receptoren wordt opgenomen door fundamentele neurofysiologische instrumentatie, en een omvormer wordt gebruikt voor het gelijktijdig meten van kracht die wordt gegenereerd door het stimuleren van een motorische zenuw. Daarnaast laten we zien hoe de neuronen vlek voor een snelle beoordeling van hun anatomische regeling of voor permanente bevestiging. Vlekken onthult anatomische organisatie die representatief is voor chordotonal organen in de meeste schaaldieren. Het vergelijken van de spanning zenuw reacties op de proprioceptieve reacties is een effectief leermiddel bij het bepalen hoe deze sensorische neuronen functioneel worden gedefinieerd en hoe de anatomie is gecorreleerd aan de functie. Drie kleuringstechniekenworden waardoor onderzoekers en docenten een werkwijze die ideaal is voor hun laboratorium kiezen.
Introduction
Proprioceptie is de sensatie van ledematen positie en beweging dat gecoördineerd motorisch gedrag mogelijk maakt. Proprioceptoren bestaan uit stand (statisch) en beweging (kinetische) receptoren. Bij insecten en schaaldieren, chordotonal organen zijn de structuren die deze informatie verstrekken aan de CNS 1. Niet alle chordotonal organen omvatten een gezamenlijke, maar ze kunnen nog steeds gezamenlijke bewegingen te controleren door hun gehechtheid aan de apodemes (pees achtige structuren) die overspannen het gewricht en bewegen in samenwerking met de skeletspieren en gezamenlijke articulatie. Krab benen zes verbindingen, elk met een of twee chordotonal organen 2. Typisch een chordotonal orgel heeft 60-100 of meer sensorische neuronen ingebed in een elastische streng, neuronen die statische gezamenlijke positie, richting en snelheid van de beweging 3-6 signaleren. De inbreng van chordotonal organen voor elke verbinding en been wordt dan centraal verwerkt waardoor gecoördineerde bewegingen door het dier.
<p class="jove_content"> De krachten die beenspieren produceren tijdens isometrische en isotone contracties worden gedetecteerd door spanning receptoren geassocieerd met spiervezels en hun bijlagen aan apodemes7-9. In het schaaldier lopende poot protocollen die volgen geven we methodologie voor opnamen van primaire sensorische neuronen die proprioceptie controleren en de neuronen die reageren op krachten die ontstaan door spiervezels. Een techniek voor het activeren beenbewegingen en kwantificeren kracht generatie ook gepresenteerd als anatomische technieken die kunnen worden gebruikt om de rangschikking van deze perifere zenuwstelsel structuren te karakteriseren.De onderstaande procedures aangetoond in staat structurele en functionele analyse van de neuronen die beide soorten receptoren opzichte van hun locatie op een chordotonal elastische draad en apodeme innerveren. Om dit te illustreren, gebruiken we de propodite-dactylopodite (PD) chordotonal orgel, het orgaan dat het meest distale segment van de krab been 3 overspant.Hoewel gedetailleerde elektrofysiologische studies begon in de jaren 1930 en worden nog steeds uitgevoerd vandaag, zijn sommige aspecten bekend is over de segmentale aansluitingen van proprioceptoren in de verschillende gewrichten en hun rol in de gecoördineerde controle van muscles10-16 geworden. Creëren van de structuur-functie relatie tussen de proprioceptieve organen, spieren en het zenuwstelsel zal verder helpen definiëren deze rollen. Bijvoorbeeld, het labelen van de somata en distale eindes van spanning neuronen ingebracht in de apodeme zullen hun locatie ten opzichte onthullen spiervezels 8,17-21.
We presenteren drie kleuringen voor schaaldier benen die kunnen worden gebruikt in onderzoek of academische laboratoria. Methyleenblauw kleuring biedt geschikte contrast voor spieren en zenuwen en wordt aanbevolen als een eenvoudige techniek voor studenten om de anatomie te leren. Labs die fluorescentie microscopie opstellingen hebben kunnen selectiever neuronale kleuring te bereiken door kort blootstellen van de zenuwTussen de vitale kleurstof 4-di-2-ASP. Het derde alternatief is CoCl2 opvulling, die vlekken en herstelt de neuronen, en geen fluorescentie beeldvorming vereisen. Hoewel het arbeids-en tijdsintensief, deze kleuring proces geeft een hoog contrast en specificiteit voor de zenuwen die zijn gevuld. Samen deze technieken kunnen worden gebruikt voor het vergelijken van verschillende chordotonal organen, niet alleen binnen een ledemaat of tussen ledematen, maar ook onder andere schaaldieren en insectensoorten 20-22. Blauwe krabben (C. sapidus) gebruikt in fysiologische opnames en voor anatomische vlekken zijn direct beschikbaar rondom de zuidelijke en zuidoostelijke grens van de Verenigde Staten. Deze soort dient als een vertegenwoordiger van de chordotonal en spanning zenuw regelingen in de meeste krabben. Laboratoria aan de westkust zal de voorkeur aan de veel grotere Dungeness krab (Cancer magister) te gebruiken voor deze experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze reeks experimenten is 1) de fundamentele beginselen van extracellulaire registraties leren en vertonen van een herkenbare proprioceptieve orgel en spanning zenuw en 2) om het belang van anatomische mapping benadrukken in relatie tot fysiologische functie van bepaalde sensorische systemen. Deze experimentele benadering en de gebruikte diermodellen zijn goedkoop en relatief eenvoudig uit te voeren in neurofysiologie onderwijslaboratoria.
De neuronen van chordotonal organen van twee specifieke functionele types, degenen die reageren op beweging en degenen die reageren op statische posities. Single cell opnamen van verschillende chordotonal organen, ongeacht welke verbinding wordt onderzocht, hebben aangetoond dat dit het geval is 3,5. Inderdaad, chordotonal organen in verband met de antennaal gewrichten van kreeften onthullen dezelfde twee zintuiglijke soorten en basisanatomie 27. In aanvulling op dat er twee soorten neuronen (beweging en positiop), de neuronen delen dezelfde anatomische regeling op hun respectieve elastische strengen. De grote somata zich proximaal aan de streng meestal behoren tot de dynamische beweging gevoelige neuronen. Neuronen die statische posities signaal kleine somata en zijn distaal gelegen. Deze cellen zijn stimulerende werking. De PD joint bevat slechts een enkele chordotonal orgel terwijl er twee chordotonal organen in het carpaal-propodus (CP) en Merus-carpus (MC) gewrichten.
De dissectie om proprioceptieve structuren bloot te leggen in blauwe krabben (C. sapidus) voor elektrofysiologische opname vereist een strategie die het mogelijk maakt gezamenlijke bewegingen plaatsvinden in de natuurlijke positie tijdens het opnemen van sensorische neuronen. De spanning zenuw voor de opener spier in het lopende poot, is een zeer fijne zenuw bestaat uit verschillende neuronen. Tenzij zorg wordt besteed, de spanning zenuw en de motorische zenuw innerveren de spier te stimuleren, kunnen tijdens deze dissectie worden beschadigd. Vooroptimale opnamen de zuigkracht elektroden moeten worden afgestemd op de grootte van de zenuw. Opnamen zijn gemakkelijk toegankelijk in een student laboratorium met behulp van een 30-40x vergroting dissectiemicroscoop en low-end micromanipulators.
Toekomstige experimenten die interessant zou zijn om na te streven met de gezamenlijke chordotonal organen zou zijn om de structurele en fysiologische profielen tijdens been regeneratie in verschillende soorten onderzoeken in verschillende stadia van de levenscyclus als een vervolg op een eerste studie die Cancer magister 19,26 gebruikt . Vragen die nog moeten worden aangepakt zijn: 1) heeft de distributie en de organisatie van kunstmatige neuronen zijn afhankelijk van de leeftijd van het dier wanneer het regenereren van een ledemaat, 2) zijn de axonale projecties aan de CNS (buikzenuwkoord) in een regenererende ledematen functioneel of toch niet neem de tijd en het gezamenlijk gebruik van functionele verbindingen tot stand, en 3) wat er gebeurt met de afgehakte axonen proximaal van de autotomie vliegtuig toen de ledematen is autotomized? 28
Schaaldieren voldoen aan milieuomstandigheden en de omringende temperatuur, maar het is onduidelijk hoe deze coördinatie te handhaven binnen een neuraal circuit neuronen veranderen hun activiteit in reactie op temperatuurveranderingen. Een langzame tempo van verandering kan het dier laten wat tijd voor acclimatisatie, terwijl een snelle verandering kan not29, 30. Fysiologische veranderingen in de pH of osmolariteit te wijten aan het metabolisme, gedrag 31, of milieueffecten kunnen soortgelijke uitdagingen presenteren aan neurale circuits die betrokken zijn bij proprioceptie. Deze schaaldier preparaten zijn ideaal voor het aanpakken van dergelijke problemen, omdat hun functie goed gekarakteriseerd op een enkele cel niveau.
In dit protocol hebben we de fysiologische betekenis van spanning neuronen in het toezicht kracht die door de opener spier aangetoond. Deze spanning receptoren kunnen hun locatie binnen de apodeme worden opgespoord met behulp van kleuringen. Dezeneuronen, zoals bij zoogdieren, sporen kracht op verschillende niveaus en aanwerving van extra neuronen als de kracht toeneemt. De frequentie activiteit is gerelateerd aan de stimulatiefrequentie van de motor neuron tot verzadiging in ontvangst bereikt. Met behulp van een quick release protocol met de gebogen dactylus gewricht, spanning activiteit verdwijnt snel, maar keert dan terug bij het herwinnen van spanning in een volledig uitgeschoven gewricht. Dit is een klassieke experimentele procedure om de kracht gemeten spanning receptoren illustreren. Verschillende neuromodulators kan worden toegepast op de bereiding te zien hoe het effect van de ontwikkeling van kracht en neuronale respons. Een van de belangrijke aspecten is hoe de neurale reacties worden verwerkt en geïntegreerd in het centrale zenuwstelsel en hun invloed op de activiteit van de motorische neuronen. De technieken die we hebben laten zien zodat men om te beginnen om meer informatie over de spanning (zintuiglijke) zenuw-motorneuron circuit functie, dwz signaal in een intacte been om het ganglion en weer terug te pakkende spier.
De kleuringen aangetoond zijn de sleutel tot het begrijpen van de fysiologie van sensorische neuronen die proprioceptieve organen innerveren. Anatomische opstelling van de neuronen op basis van functie en de grootte van de soma vergelijkbaar zijn in de verschillende organen in de chordotonal krabbenpoten. Het is niet bekend of vergelijkbare neuronale regelingen ook worden gevonden in andere schaaldieren soorten of insecten. De combinatie van fysiologische opnames van enkele cellen en in kaart brengen van de locatie biedt directe structuur-functie relaties. De lange termijn bewaring van de anatomische regeling met CoCl2 kleuring en fixatie kan men herhaaldelijk maatregelen maken en beoordelen van de structurele regeling.
Proprioceptie en spanning ontvangst van skeletspieren zijn zintuiglijke modaliteiten die gecoördineerde gedragingen en reacties op externe en interne omgeving voor gelede dieren in een verscheidenheid van de skeletspieren configuraties. De spier receptor orgel in de buik van de rivierkreeft is een andere goed gedocumenteerde voorbereiding (zie de Crawdad Project; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) voor onderwijsdoeleinden van proprioceptie met slechts twee neuronen per abdominale hemi-segment 23 . In staat zijn om op te nemen van enkele neuronen tot sensorische zenuwbanen geeft nadere bijzonderheden die helpen bij het begrijpen van de basisprincipes van de zintuiglijke receptie. Deze relatief eenvoudige schaaldier preparaten toelaten dat een fundamentele aspecten van proprioceptie en spanning controle pakken, met de potentie om de neurale circuits die centrale integratie van proprioceptieve en andere sensorische input 9-12, 32, 33 mogelijk te bepalen.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor de artistieke bijdragen van Hyewon Cooper.
Materials
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
Referanslar
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. . First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. . The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -. S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
