استقبال الحس العميق والتوتر المستقبلات في اطراف سرطان البحر: تمارين مختبر طالبة
Özet
وأظهرت تقنيات الفسيولوجية والتشريحية لمعالجة وظيفة وهيكل لproprioceptors المشتركة ومستقبلات توتر العضلات في الاطراف المشي القشريات.
Abstract
الغرض الأساسي من هذه الإجراءات هو إظهار لأغراض التدريس والبحث كيفية تسجيل نشاط الخلايا العصبية الحسية يعيشون الرئيسية المسؤولة عن استقبال الحس العميق كما هي الكشف عن موقف مشترك والحركة، وتوتر العضلات. يتم تسجيل النشاط الكهربائي من proprioceptors القشريات ومستقبلات التوتر الأجهزة العصبية الأساسية، ويتم استخدام محول لقياس القوة في وقت واحد التي يتم إنشاؤها من خلال تحفيز العصب المحرك. بالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح كيفية وصمة عار على الخلايا العصبية لإجراء تقييم سريع للترتيبها التشريحية أو لتثبيت دائم. تلطيخ يكشف منظمة التشريحية التي هو ممثل أجهزة chordotonal في معظم القشريات. مقارنة استجابات التوتر العصبي لاستجابات التحفيز هو أداة تعليمية فعالة في تحديد كيفية تعريف هذه الخلايا العصبية الحسية وظيفيا وكيف يرتبط التشريح إلى وظيفة. ثلاث تقنيات تلطيخوتعرض مما يسمح للباحثين ومدربين لاختيار الأسلوب الذي هو المثل الأعلى للمختبر بهم.
Introduction
استقبال الحس العميق هو الإحساس من موقف الطرف والحركة التي تمكن السلوك منسقة السيارات. تتكون Proprioceptors للموقف (ثابت) وحركة (حركي) المستقبلات. في الحشرات والقشريات، وأجهزة chordotonal هي الهياكل التي توفر هذه المعلومات إلى الجهاز العصبي المركزي 1. ليس كل الأجهزة chordotonal تمتد مشتركة لكنها ما زالت قادرة على رصد تحركات مشتركة بسبب تمسكهم على apodemes (وتر مثل هياكل) التي تغطي المشتركة والتحرك بالتعاون مع العضلات والهيكل العظمي وصياغة مشتركة. الساقين سلطعون دينا ستة المفاصل، ولكل منها واحد أو اثنين من أجهزة chordotonal 2. عادة ما يكون لديه جهاز chordotonal 60-100 أو أكثر الخلايا العصبية الحسية جزءا لا يتجزأ من داخل حبلا المرنة، والخلايا العصبية التي تدل على موقف مشترك ثابت، اتجاه وسرعة الحركة 3-6. ثم تتم معالجة المدخلات من الأجهزة chordotonal في كل المفاصل وساق مركزيا السماح حركات منسقة من قبل الحيوان.
<p class="jove_content"> يتم الكشف عن القوى التي تنتج عضلات الساق أثناء تقلصات متساوي القياس ومتساوي التوتر عن طريق المستقبلات التوتر المرتبطة ألياف العضلات ومرفقاتها إلى apodemes7-9. في القشريات بروتوكولات الساق المشي التي تتبع نقدم منهجية لتسجيلات من الخلايا العصبية الحسية الأولية التي ترصد استقبال الحس العميق والخلايا العصبية التي تستجيب للقوات التي تم إنشاؤها بواسطة ألياف العضلات. وتقدم تقنية لتفعيل حركات الساق وقياس قوة الجيل أيضا، فضلا عن تقنيات التشريحية التي يمكن استخدامها لوصف ترتيب هذه الهياكل الجهاز العصبي المحيطي.تمكين الإجراءات موضح أدناه التحليل البنيوي والوظيفي للخلايا العصبية التي يعصب كلا النوعين من المستقبلات النسبية لموقعها على حبلا مرونة chordotonal وapodeme. لتوضيح، ونحن نستخدم propodite-dactylopodite (PD) chordotonal الجهاز، الجهاز الذي يمتد القاصي معظم الجزء من الساق سرطان البحر 3.على الرغم بدأت الدراسات الكهربية مفصلة في 1930s و لا يزال يجري تنفيذها اليوم، أصبحت بعض جوانب معروف عن اتصالات قطعي في Proprioceptors في مختلف المفاصل ودورهم في مراقبة منسقة من muscles10-16. وإقامة العلاقة بين الهيكل وظيفة بين الأجهزة التحفيز والعضلات والجهاز العصبي مزيد من المساعدة في تحديد هذه الأدوار. على سبيل المثال، وصفها somata والنهايات البعيدة من الخلايا العصبية التوتر إدراجها في apodeme سوف تكشف عن الموقع النسبي لألياف العضلات 8،17-21.
نقدم ثلاث تقنيات لتلطيخ الساقين القشريات التي يمكن استخدامها في الأبحاث أو المختبرات الأكاديمية. يوفر تلطيخ الأزرق الميثيلين النقيض مناسبة للعضلات والأعصاب والنحو الموصى به من تقنية بسيطة للطلاب لتعلم علم التشريح. يمكن أن يكون مختبرات الاجهزة مضان المجهري إنجاز تلطيخ الخلايا العصبية أكثر انتقائية من خلال تعريض لفترة وجيزة العصبق إلى حيوية صبغ 4-دي-2-ASP. البديل الثالث هو كوكلي 2 الردم، التي بقع وإصلاح الخلايا العصبية، و لا يتطلب التصوير مضان. على الرغم من أنه هو العمل والوقت مكثفة، وهذه العملية تلطيخ يعطي تباين عالية وخصوصية للأعصاب التي يتم شغلها. معا هذه التقنيات يمكن استخدامها لمقارنة مختلف الأجهزة chordotonal، ليس فقط داخل أحد أطرافه أو بين أطرافه، ولكن أيضا من بين الأنواع الأخرى القشريات والحشرات 20-22. متوفرة السرطانات الزرقاء (C. sapidus) المستخدمة في التسجيلات الفسيولوجية والتشريحية لتلطيخ جميع أنحاء الحدود الجنوبية والجنوبية الشرقية للولايات المتحدة. يخدم هذا النوع كممثل للترتيبات العصبية والتوتر chordotonal وجدت في معظم السرطانات. سوف المختبرات على الساحل الغربي يفضلون استخدام أكبر بكثير سرطان البحر دونجينيس (الماجستير السرطان) لهذه التجارب.
Protocol
Representative Results
Discussion
الغرض من هذه المجموعة من التجارب هو 1) لتعليم ويحمل المبادئ الأساسية للتسجيلات خارج الخلية من جهاز التحفيز تحديدها والتوتر العصبي و2) التشديد على أهمية رسم الخرائط التشريحية فيما يتعلق ظيفة فسيولوجية معينة أنظمة حسية. هذا النهج التجريبية والنماذج الحيوانية المستخدمة هي غير مكلفة وسهلة نسبيا لإجراء التدريس في مختبرات الفسيولوجيا العصبية.
الخلايا العصبية من أجهزة chordotonal نوعان ظيفية محددة، وتلك التي تستجيب لتلك الحركة والاستجابة للمواقف ثابتة. تسجيلات خلية واحدة من مجموعة متنوعة من الأجهزة chordotonal، بغض النظر عن أي يتم فحص المشتركة، أظهرت أن تكون هذه هي الحال 3،5. في الواقع، وأجهزة chordotonal المرتبطة المفاصل antennal من الكركند تكشف عن نفسها نوعين الحسية والتشريح الأساسية 27. بالإضافة إلى أن يكون هناك نوعين الخلايا العصبية (الحركة وpositiعلى)، والخلايا العصبية تشترك في نفس الترتيب التشريحية على خيوط مرنة لكل منهما. وsomata كبيرة تقع قريب على حبلا تميل إلى تنتمي إلى ديناميكية الخلايا العصبية الحساسة الحركة. الخلايا العصبية التي تدل على مواقع ثابتة لها somata الصغيرة وتقع بشكل أقصى. هذه الخلايا تنشط tonically. المفصل PD يحتوي فقط على جهاز واحد chordotonal في حين أن هناك اثنين من أجهزة chordotonal في رسغ-propodus (CP) وmerus-رسغ (MC) المفاصل.
تشريح لفضح هياكل التحفيز في السرطانات الزرقاء (C. sapidus) لتسجيل الكهربية يتطلب استراتيجية تسمح الحركات المشتركة الذي سيعقد في المواقف الطبيعية أثناء التسجيل من الخلايا العصبية الحسية. العصب التوتر لعضلة الساق في المباراة الافتتاحية المشي هو العصب ناعم جدا تتكون من عدة خلايا عصبية. ما لم تتخذ الرعاية، العصب التوتر فضلا عن العصب المحرك التعصيب العضلات ليكون حافزا، يمكن أن تتلف خلال هذه تشريح. إلىتسجيلات الأمثل الأقطاب شفط تحتاج إلى أن يكون متلائما مع حجم العصب. تسجيلات يمكن الوصول إليها بسهولة في المختبر الطالب باستخدام 30-40X التكبير المجهر تشريح وmicromanipulators المنخفضة نهاية.
أن التجارب المستقبلية التي من شأنها أن تكون مثيرة للاهتمام لمتابعة مع الأجهزة chordotonal مشتركة تكون لدراسة الأوضاع الهيكلية والفسيولوجية خلال تجديد الساق في الأنواع المختلفة في مراحل مختلفة في دورة حياة كمتابعة لدراسة الأولية التي تستخدم لمكافحة السرطان الماجستير 19،26 . الأسئلة المتبقية التي يتعين معالجتها هي 1) لا توزيع وتنظيم الخلايا العصبية مجدد تعتمد على عمر الحيوان عند تجديد أحد أطرافه، 2) هي التوقعات محور عصبي إلى الجهاز العصبي المركزي (الحبل البطني العصب) في أحد أطرافه تجديد وظيفية أو يفعل يستغرق وقتا طويلا والاستخدام المشترك لتأسيس اتصالات وظيفية، و 3) ما يحدث للمحاور قطعت الأقرب إلى الطائرة انشطار ذاتي عند الطرف هو autotomized؟ 28
القشريات تتوافق مع الظروف البيئية ودرجة الحرارة المحيطة بها، ولكن من غير الواضح كيف الحفاظ على التنسيق داخل الدوائر العصبية الخلايا العصبية كما يغير نشاطهم في استجابة للتغيرات في درجة الحرارة. وبطء وتيرة التغيير قد تسمح للحيوان بعض الوقت للتأقلم في حين أن التغير السريع قد not29، 30. التغيرات الفسيولوجية في درجة الحموضة أو الأسمولية بسبب التمثيل الغذائي والسلوك 31، أو الأثر البيئي قد يطرح تحديات على غرار الدوائر العصبية المشاركة في استقبال الحس العميق. هذه الاستعدادات القشريات تعتبر مثالية لمعالجة هذه الأنواع من المشاكل بسبب وظيفتها ويتميز كذلك على مستوى خلية واحدة.
في هذا البروتوكول لقد أثبتنا أهمية الفسيولوجية للخلايا العصبية التوتر في رصد القوة التي تولدها العضلات فتحت. هذه المستقبلات التوتر يمكن أن تعزى إلى موقعها داخل apodeme باستخدام إجراءات تلطيخ. هؤلاءالخلايا العصبية، كما هو الحال في الثدييات، والكشف عن القوة على مختلف المستويات، وتجنيد الخلايا العصبية إضافية كما يزيد القوة. تردد في النشاط هو ذات الصلة إلى التردد تحفيز الخلايا العصبية الحركية حتى يتم التوصل إلى التشبع في الاستقبال. باستخدام بروتوكول الإفراج السريع مع المشترك إصبع استعرضوا والنشاط التوتر يختفي بسرعة ولكن بعد ذلك يعود على استعادة التوتر في مشتركة ممتدة بشكل كامل. هذا هو الإجراء التجريبي الكلاسيكي لتوضيح قوة تقاس مستقبلات التوتر. neuromodulators مختلفة يمكن تطبيقها على إعداد لنرى كيف يؤثر تطوير القوة والاستجابة العصبية. واحد من الجوانب المهم هو كيف تتم معالجة الردود العصبية ومتكاملة في الجهاز العصبي المركزي وتأثيرها على نشاط الخلايا العصبية الحركية. تقنيات أظهرنا تسمح لأحد للبدء في معالجة مزيد من المعلومات حول التوتر (الحسية) الأعصاب الحركية وظيفة الخلايا العصبية الدائرة، أي إشارة في الساق سليمة إلى العقدة والعودةإلى العضلات.
الإجراءات تلطيخ أثبتت هي المفتاح لفهم علم وظائف الأعضاء من الخلايا العصبية الحسية التي يعصب أجهزة التحفيز. الترتيب التشريحي للخلايا العصبية على أساس الوظيفة وحجم سوما متشابهة في مختلف الأجهزة chordotonal داخل الساقين سرطان البحر. ومن غير المعروف ما إذا تم العثور على ترتيبات مماثلة أيضا الخلايا العصبية في الأنواع أو الحشرات القشريات الأخرى. الجمع بين التسجيلات الفسيولوجية من الخلايا واحد ورسم خرائط الموقع يسمح العلاقات ظيفة الهيكل مباشرة. الحفاظ على المدى الطويل للترتيب التشريحية مع كوكلي 2 تلطيخ والتثبيت يسمح احد لجعل متكررة التدابير وتقييم الترتيبات الهيكلية.
استقبال الحس العميق واستقبال التوتر من عضلات الهيكل العظمي هي طرائق الحسية التي تمكن السلوكيات والردود على البيئة الخارجية والداخلية منسقة للحيوانات مفصلية في مجموعة متنوعة من تكوين العضلات والهيكل العظميق. الجهاز مستقبلات العضلات في البطن من جراد البحر هو إعداد أخرى موثقة جيدا (انظر مشروع Crawdad؛ http://www.crawdad.cornell.edu/ ) لأغراض التدريس من استقبال الحس العميق مع اثنين فقط من الخلايا العصبية في البطن نصفي الجزء 23 . أن تكون قادرة على تسجيل من الخلايا العصبية واحد لحزم العصب الحسي يوفر المزيد من التفاصيل التي تساعد في فهم المبادئ الأساسية لاستقبال الحسية. هذه الاستعدادات القشريات بسيطة نسبيا تسمح لأحد لمعالجة الجوانب الأساسية لاستقبال الحس العميق ورصد التوتر، مع القدرة على تحديد الدوائر العصبية التي تمكن التكامل المركزية للمدخلات الحسية التحفيز وغيرها من 9-12، 32، 33.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون للإسهامات الفنية Hyewon كوبر.
Materials
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
Referanslar
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. . First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. . The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -. S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
