nucleases مصمم مثل nucleases إصبع الزنك (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs) يمكن استخدامها لتعديل جينوم الفأر الأجنة سابق للانغراس عن طريق إحداث كلا نهاية امتماثلان الانضمام (NHEJ) وإعادة التركيب مثلي (HR) مسارات. هذه التطورات تمكين جيل من الفئران السريع مع التعديلات الجينية دقيقة.
الفئران المعدلة وراثيا تحمل تعديلات في مواقع محددة الجينوم (خروج المغلوب، الضربة القاضية في) هي ذات أهمية حيوية لتشريح النظم البيولوجية المعقدة، فضلا عن الأمراض التي تصيب الإنسان لنمذجة واختبار الاستراتيجيات العلاجية. التطورات الحديثة في استخدام nucleases مصمم مثل nucleases إصبع الزنك (ZFNs)، والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs)، وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (CRISPR) / (CAS) المرتبطة CRISPR 9 نظام للموقع الهندسة الجينوم محددة فتح إمكانية لإجراء تعديل سريع الجينوم المستهدفة في الواقع أي الأنواع المختبر دون الحاجة إلى الاعتماد على الجذعية الجنينية (ES) تكنولوجيا الخلايا. يبدأ تجربة تحرير الجينوم عادة مع تحديد المواقع المستهدفة نوكلياز مصمم ضمن الجينات في المصالح تليها بناء المجالات الحمض النووي ملزم مخصصة لتوجيه النشاط نوكلياز إلى موضع الجيني محددة المحقق. البلازميدات مصمم نوكلياز في المختبر <م /> كتب لتوليد مرنا لMicroinjection من البويضات المخصبة الماوس. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتحقيق المستهدف تعديل الجينوم عن طريق الحقن المباشر للTALEN مرنا في البويضات المخصبة الماوس.
الفئران هي الآن الأكثر شعبية منصة لتوليد النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. الأدوات تنوعا للهندسة الوراثية للجنين الفأر 1-3 وقد تم تمديد مؤخرا من قبل نهج التحرير الجينوم على أساس nucleases مصمم مثل nucleases إصبع الزنك (ZFN) 4-6، والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALEN) 7،8، وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (CRISPR) / (CAS) 9 المرتبط CRISPR نظام 9. ZFN وظيفة TALEN كما أزواج اثنين من المجالات مصمم خصيصا البروتين على أساس ملزم الحمض النووي (صفائف من الزنك الاصبع البروتينات وتكرار متغير ثنائي بقايا (RVDs)، على التوالي) التي تقترن كل لنوكلياز داخلية FokI 10-12. على العكس، يتم توفير خصوصية Cas9 بوساطة الانقسام الحمض النووي عن طريق transactivating الرنا CRISPR (crRNA وtracrRNA، والتي يمكن أيضا أن تكون مجتمعة في واحدة جزيء RNA خيالية تسمى دليل الحمض النووي الريبي) 11 التي تعمل في مجمع معالبروتين CRISPR.
TALENs مع تسلسل محدد من RVDs يمكن بناؤها بسرعة عن طريق المجربون الفردية مع العديد من الاستراتيجيات لاختيار التجمع 13-17. CRISPR/Cas9 عود الجيل كثيفة العمالة حتى أقل من nucleases مصمم، ولكن خصوصية دليل الحمض النووي الريبي الحمض النووي ملزمة لم يتم حل تماما 18،19. جيل من ZFNs مخصص وقد تم حتى الآن تقتصر على مختبرات الأكاديمية المتخصصة والتجارية للموردين مثل Sangamo العلوم البيولوجية والخدمة سيغما CompoZr.
بشكل عام، يهدف الجينوم التحرير مع nucleases مصمم على تقديم فواصل حبلا مزدوجة (DSB) في مواضع محددة الجيني، والتي تجذب فيما بعد نهاية امتماثلان الانضمام (NHEJ) أو إعادة التركيب مثلي (HR) الأجهزة إصلاح الحمض النووي 10،12. إصلاح NHEJ بوساطة من جهاز تسوية المنازعات غالبا ما يؤدي إلى إدخال الإدراج والحذف على مقربة من موقع الإصلاح. NHEJ بالتالي إصلاح جويمكن استغلالها لضرب وظيفة الجين المستهدف من خلال إدخال طفرة الإطار تحول في الجينات ترميز بروتين تسلسل 4،7،9. بدلا من ذلك، بالإضافة إلى تعريف أو استبدال المعلومات الوراثية يمكن أن يتحقق من خلال توفير المانحة الحمض النووي مع nucleases المصمم. وتضم الجهات المانحة والحمض النووي تسلسل الحمض النووي مصمم المحقق يحيط بها مناطق التماثل مع مكان الهدف، وبالتالي تخدم كنموذج لإصلاح جهاز تسوية المنازعات عن طريق الموارد البشرية. كلا البلازميدات 5،6،20 واحد أليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل 8،9،21 وقد استخدمت بنجاح الجهات المانحة. لا تتطلب NHEJ-HR ولا بوساطة الجينوم تحرير إدخال علامة اختيار في جينوم الجنين الماوس، الأمر الذي يجعل هذه الاستراتيجيات لا سيما مناسبة تماما لخلق تغييرات صغيرة في تسلسل النوكليوتيدات من دون إزعاج العمارة الوراثية بشكل عام.
في هذا البروتوكول وصفنا جميع الإجراءات الضرورية لتحرير الجينوم فيجنين فأر باستخدام TALENs. وتشمل هذه 1) تحديد موقع الهدف TALEN 22، 2) بناء TALENs كتبها golden بوابة الاستنساخ 13، 3) في المختبر توليف TALEN مرنا، 4) Microinjection من TALEN مرنا في البويضات المخصبة الماوس، 5) العمليات الجراحية لنقل الأجنة و6) تحليل الطفرات المستحثة TALEN في الحيوانات مؤسس. ونحن نركز على TALEN مرنا حقن مكروي والفرز من المؤسسين لNHEJ التي يسببها الإدراج / حذف. لهذا الغرض، ونحن قد ولدت يبني TALEN bifunctional التي تسمح على حد سواء التعبير في خلايا الثدييات عندما transfected البلازميدات وكما في التوليف المختبر من TALEN مرنا لحقن مكروي في أجنة الفئران. تتكون هذه التركيبات حكاية العمود الفقري اقتطاع 23 تنصهر لheterodimeric FokI النطاقات 24،25 الأمثل لتحرير الجينوم في خلايا الثدييات. ويمكن أيضا أن يعتمد هذا البروتوكول لMicroinjection من غيرها nucleases مصمم أو حقن مشتركة من nucleases مصممويبني المانحة (وقد وصفت تصميم المانحين الحمض النووي في المطبوعات الفنية الممتازة التي Wefers آخرون 26،27).
بيان الأخلاقية
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من المكتب البيطري كانتون كانتون زيوريخ.
مصمم يحركها نوكلياز الجينوم النهج التحرير قمنا بمد بشكل كبير من مجموعة من الأنواع قابلة للتعديلات التي تستهدف جينوم كل منهما 10،12. في الفئران، وقد تم في خلايا ES-استهداف الجينات تقنية قياسية لأكثر من عقدين من الزمن؛ ومع ذلك، فقد ثبت صعوبة في التكيف مع الخلايا الجذعية الجنينية من الأنواع الأخرى من الماوس، وإن كان هناك بعض النجاح الذي تحقق مؤخرا في الفئران خلايا ES. حتى مع توافر "قبالة الجاهزة للاستخدام" الماوس ES استنساخ الخلايا المستهدفة الجينات التي تقدمها اتحادات مثل EUCOMM، KOMP، أو NorCOMM 3 الجينوم التحرير من قبل ZFN وTALEN يوفر أعلى من الدقة والمرونة فيما يتعلق الطيف من التعديلات التي يمكن أن تكون أدخلت جينوم الفأر. الحيوانات مؤسس تحمل طفرات بوساطة نوكلياز يبدو أن غاية الجرثومية خط المختصة 4-6،20،21، وهي ليست الحال دائما للالوهم القادمة من حقن الكيسة الخلايا ES. وبالتالي، في بعض الحالات Microinjection من قصريمكن nucleases igner يؤدي إلى توليد أسرع بكثير من خطوط الماوس رواية مع بعض التعديلات الجينوم المستهدفة.
الجيل الناجح من الفئران خروج المغلوب عن طريق الحقن من ZFN وTALEN يعتمد إلى حد كبير على نشاط الزوج نوكلياز حقن. وقد ثبت TALENs أن يكون لها نسبة نجاح عالية في استهداف مجموعة واسعة من الجينات في عدد من الكائنات الحية؛ ومع ذلك، تشير الدراسات الحديثة أن TALEN ملزمة حساس للالسيتوزين مثيلة 30،31. وهكذا، ولدت حديثا نوكلياز أزواج، على سبيل المثال TALENs المستنسخة في ناقلات pCAG-T7، يمكن عابر في خط الخلية الماوس مثل NIH-3T3 أو العصبية -2A، التي تحاكي الدولة لونين من الجنين الماوس إلى حد ما. هنا، والنشاط نوكلياز يمكن تقديرها باستخدام نوكلياز داخلية مقايسة T7 أو تقييد هضم المنتج PCR كما هو موضح في القسم 5 قبل التوليف مرنا وحقن مكروي. نوصي التسلسل الجيني في المنطقة من مصلحة في احترامإيف خط الخلية وسلالة الماوس تستخدم للتجارب حقن مكروي.
في بيضات ملقحة الماوس، سوف TALEN مختلفة أو ZFN أزواج تعمل على النحو الأمثل بتركيزات مختلفة مرنا وبالتالي فإن تركيز العمل الأمثل للنوكلياز مرنا microinjected قد تضطر إلى أن تحدد تجريبيا. اعتمادا على الزوج نوكلياز، وتركيز منخفض جدا يؤدي إلى أي انشقاق في حين مرتفعة جدا يمكن أن يؤدي إلى الجنين الفتك. اعتمادا على الزوج نوكلياز، لقد حققنا نجاحا باستخدام مجموع تركيزات منخفضة مرنا قدر 2 نانوغرام / ميكرولتر ويصل إلى 200 ميكروغرام / شباط. هذه الآثار يصعب التنبؤ بها من التجارب في خلية ثقافة والأمثل تركيز نوكلياز لكلا بقاء الجنين ومعدل تعديل موضع الهدف يحتاج إلى أن تحدد تجريبيا.
ZFN نشطة للغاية أو TALEN يمكن يلتصق تسلسل هدفهم تجاوز مرحلة خلية واحدة من الجنين، وبالتالي يسبب microinjected أنماط معقدة من الطفرات ود الاصباغ في المؤسسين. نحن وآخرون 4 لاحظت ثلاثة أو أكثر من الأليلات تحور واضح في مؤسس واحد (الشكل 5C). وبالتالي، عند إنشاء خط الفأرة الجديدة من هؤلاء المؤسسين، والأبناء لا بد من فحص بعناية من قبل تسلسل لوجود الطفرة مواتية منذ المقايسات الهضم تقديم الدليل الوحيد على أن طفرة غير معروف موجودا.
واحدة من الانتقادات في كثير من الأحيان اعرب ضد أنظمة ZFN وTALEN هو احتمال أن هذه nucleases هي أيضا قادرة على الشق تسلسل الحاضر في مكان آخر في الجينوم التي تشبه إلى المواقع المستهدفة. وقد لوحظت هذه التأثيرات خارج الهدف مع الكواشف الجيل المبكر باستخدام المجال homodimeric FokI، وصممت ثوابت مغاير للتخفيف من آثار خارج الهدف 25. يمكن التنبؤ مواقع خارج هدفا محتملا إلى حد ما في سيليكون 32،33 وفرزهم من قبل PCR والتسلسل. ميزة واضحة سو باستخدام ZFNs وTALENs لتوليد الفئران بدلا من خطوط الخلايا هي إمكانية إزالة من الطفرات الهدف المنشود غير المرتبطة لتعديل الجينوم عن طريق إجراء العديد من backcrosses لسلالة من النوع البري في الاختيار. لتحليل عدد كبير من الفئران مؤسس، الجيل القادم التسلسل العميقة للمنتجات PCR ولدت من موضع استهداف ونوكلياز في سيليكون توقع خارج الهدف مواضع قد تقدم قراءات النوعي والكمي بديل لفحوصات هضم منتجات PCR.
هي الأمثل للتقنيات المساعدة على الإنجاب وصفها في هذا البروتوكول لسلالات الفئران القياسية المستخدمة في التجارب حقن مكروي مثل C57BL/6J أو B6D2F1. الفئران من أصول مختلفة، مثل سلالات الأباعد، يمكن من حيث المبدأ أن تستخدم لنهج تحرير الجينوم ويمكن أن توفر خلفية وراثية أكثر ملاءمة للأسئلة بحثية محددة. أداء تقنيات الإنجاب المساعدة مثل فرط الإباضة يمكن أن يكون prediالمديرية لعدد من سلالات 34-36 ولكن قد تحتاج إلى مزيد من التحسين لسلالات غير قياسي من أجل الحصول على عدد كاف من الأجنة لحقن مكروي نوكلياز.
إلى جانب ZFN وTALEN، والآن أدخلت nucleases مصمم جديدة مثل موجهة RNA نظام CRISPR/Cas9 9،37،38 لتطبيقات التحرير الجينوم. جميع الطرق لحقن مكروي وتحليل الحيوانات مؤسس وصفها هنا قابلة للتطبيق على CRISPR/Cas9 وسائط مستقبل تحرير الجينوم أيضا.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر مونيكا Tarnowska، كورنيليا ألبرخت، وإيوا Skoczylas للمساعدة التقنية الممتازة. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل الجبهة الوطنية الصومالية SINERGIA منحة CRSI33-125073 لPP.
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |