Дизайнерские нуклеазы, такие как цинкового пальца нуклеаз (ZFNs) и активатор транскрипции, как эффекторных нуклеаз (Таленс) может быть использована для изменения генома эмбрионов предимплантационной мыши, вызывая как негомологичных конец присоединения (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR) путей. Эти достижения позволяют быструю генерацию мышей с точными генетическими модификациями.
Трансгенные мыши, несущие по конкретным участкам модификации генома (нокаут, нокаут в) имеют жизненно важное значение для рассечения сложных биологических систем, а также для моделирования заболеваний человека и тестирования терапевтических стратегий. Последние достижения в области использования дизайнерских нуклеаз таких как цинкового пальца нуклеаз (ZFNs), активатор транскрипции, как эффекторных нуклеаз (Таленс) и кластерных регулярно interspaced коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR ассоциированных (Cas) 9 системы для сайта- конкретных генной инженерии открывают возможность для выполнения быстрого целевой модификации генома практически любых лабораторных видов без необходимости полагаться на эмбриональных стволовых (ЭС) клеток технологии. Эксперимент редактирование генома обычно начинается с определения дизайнерских нуклеазных целевых сайтов в интересующего гена с последующим строительством пользовательских доменов ДНК-связывающих направить нуклеазную активность следователю определенные геномного локуса. Дизайнер нуклеазы плазмиды в пробирке </ EM> транскрибируется генерировать мРНК микроинъекции оплодотворенных ооцитов мыши. Здесь мы предоставляем протокол для достижения целевой модификации генома путем непосредственного впрыска Talen мРНК в оплодотворенные ооциты мыши.
Мыши являются на сегодняшний день самой популярной платформой для получения трансгенных животных моделей. Универсальный набор инструментов для генной инженерии эмбриона мыши 1-3 был недавно продлен генома подходов редактирования на основе дизайнерских нуклеаз, таких как цинкового пальца нуклеаз (ZFN) 4-6, активатор транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Talen) 7,8, и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / CRISPR ассоциированных (Cas) 9 Система 9. ZFN и функция Talen как пары двух специально разработанных ДНК-связывающих доменов на основе белков (массивы из цинковых пальцев белков и повторить переменной ди-остатков (RVDS), соответственно), которые каждый, соединенных с Фоки эндонуклеазы 10-12. С другой стороны, специфичность Cas9-опосредованного расщепления ДНК обеспечивается трансактивации CRISPR РНК (crRNA и tracrRNA, которые также могут быть объединены в единый химерной молекулы РНК называется руководство РНК) 11, которые действуют в комплексе сCRISPR белка.
Таленс с определенной последовательности RVDS можно быстро строится отдельными экспериментаторов с множеством монтажных стратегий на выбор 13-17. CRISPR/Cas9 обещает еще меньше трудоемкий поколение дизайнерских нуклеаз, однако специфика направляющей РНК-ДНК связывания по-прежнему не решен 18,19. Генерация пользовательских ZFNs до сих пор ограничивается специализированных ученых лабораторий и коммерческих поставщиков, таких как Sangamo Biosciences и службой Сигма CompoZr.
В общем, геном редактирования с дизайнером нуклеаз направлена на введение двойных разрывов (ДР) на определенной локусов генома, который впоследствии привлечь негомологичных конец присоединения (NHEJ) или гомологичной рекомбинации (HR) репарации ДНК механизмов 10,12. NHEJ-опосредованной ремонт DSB часто приводит к введению вставки и удаления в непосредственной близости к месту ремонта. Таким образом NHEJ ремонт сбыть использованы для выбивания функцию гена-мишени, вводя сдвига рамки мутации внутри белок-кодирующих генов последовательности 4,7,9. Кроме того, определено добавление или замена генетической информации может быть достигнуто путем предоставления донора ДНК вместе с конструктором нуклеаз. Донор ДНК содержит следователь разработанные последовательности ДНК в окружении регионов гомологии с локуса-мишени, тем самым действуя в качестве шаблона для ремонта DSB по HR. Обе плазмиды 5,6,20 и одноцепочечные олигонуклеотиды 8,9,21 были успешно использованы в качестве доноров. Ни NHEJ-ни HR-опосредованной редактирование геном требуют введения селектируемого маркера в геном эмбриона мыши, что делает эти стратегии особенно хорошо подходит для создания небольших изменений в нуклеотидной последовательности, не нарушая общую генетическую архитектуру.
В этом протоколе описываются все необходимые процедуры для редактирования генома вмышь эмбрион с помощью Talens. К ним относятся: 1) определение целевой сайте Talen 22, 2) строительство Talens на Золотых Ворот клонирования 13, 3) синтез в пробирке Talen мРНК, 4) микроинъекции Talen мРНК в оплодотворенных ооцитов мыши, 5) хирургических процедур для переноса эмбрионов и 6) анализ Talen-индуцированного мутагенеза в основателей животных. Мы делаем ставку на Talen мРНК микроинъекции и скрининга учредителей для NHEJ-индуцированных вставками / удалений. Для этого мы сформировали бифункциональных конструкции Talen, которые позволяют как выражение в клетках млекопитающих при трансфекции как плазмиды и экстракорпоральное синтеза Talen мРНК для микроинъекции в мышиных эмбрионов. Эти конструкции содержат усеченный TALE основа 23 слит с гетеродимерным FokI областей для оптимального 24,25 редактирования генома в клетках млекопитающих. Этот протокол также может быть принята для микроинъекции других дизайнерских нуклеаз или для комбинированных инъекций дизайнерских нуклеази донорских конструкции (дизайн доноров ДНК было описано в превосходных технических публикаций по Wefers др.. 26,27).
Этические себе
Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами кантона ветеринарной Управления кантона Цюрих.
Дизайнерские нуклеазы приводом генома подходы редактирования значительно расширили спектр видов поддающихся целевых модификаций своих геномов 10,12. У мышей, ген-таргетинга в ЭС клеток был стандартный метод на протяжении более двух десятилетий; однако, это оказалось трудно адаптироваться к ЭС клеток из других, чем мыши видов, хотя были некоторые недавние успехи в крыс ЭС клеток. Даже при наличии "вне-шельфа" ген-направленных мыши ES клеточных клонов, предоставляемых консорциумов, таких как EUCOMM, KOMP или NorCOMM 3 редактирования генома по ZFN и Talen обеспечивает более высокую точность и гибкость в отношении спектра модификаций, которые могут быть вводят в геном мыши. Основатель животные, несущие нуклеазам опосредованного мутации кажутся весьма зародышевой линии компетентным 4-6,20,21, который не всегда имеет место для химер, происходящих из бластоцисты инъекций ЭС клеток. Таким образом, в некоторых случаях, микроинъекции DESigner нуклеазы может привести к значительно более быстрому поколения новых линий мышей с целевыми модификаций генома.
Успешное поколение мышей с инъекцией ZFN и Talen зависит в значительной степени от активности закачиваемой нуклеазной пары. Таленс уже было показано, что высокий уровень успеха в планировании широкий спектр генов в ряде организмов; Однако, недавние исследования показывают, что связывание Talen чувствителен к цитозин метилирования 30,31. Таким образом, вновь создаваемые нуклеазы пары, например Talens клонировали в pCAG-T7 векторов, можно трансфицировать временно в линию мыши клеток, таких как NIH-3T3 или Нейро -2a, которые имитируют хроматина состояние эмбриона мыши в некоторой степени. Здесь, нуклеазы деятельности может быть оценена с помощью Т7 эндонуклеазной анализа или ограничение дайджест продукта ПЦР, как описано в разделе 5 до синтеза мРНК и микроинъекции. Мы рекомендуем секвенирования геномной области интереса к отношениюив линию клеток и штамма мыши, используемый для микроинъекции экспериментов.
В зигот мыши, различные Talen или ZFN пар будет работать оптимально при различных концентрациях мРНК и, следовательно, оптимальное рабочее концентрация микроинъекции нуклеазы мРНК может должны быть определены экспериментально. В зависимости от пары нуклеазы, слишком низкая концентрация приведет к отсутствию расщепления в то время как слишком высока может привести к эмбриональной летальности. В зависимости от пары нуклеазы, мы имели успех, используя общую концентрацию мРНК столь же низко как 2 нг / мкл и выше, чем 200 мкг / ул. Эти эффекты трудно предсказать из экспериментов в культуре клеток и концентрации, оптимальной для нуклеазы и выживаемость эмбрионов и скорость модификация локуса-мишени должна быть определена эмпирически.
Высокоактивная ZFN или Talen может расщеплять их последовательности-мишени за пределы стадии одной клетки в микроинъецировали эмбриона и тем самым вызвать сложные схемы мутагенеза апг мозаичность в основателей. Мы и другие 4 наблюдали три или более различных мутантных аллелей в одном учредителя (Рисунок 5С). Таким образом, при создании новой линии мыши из этих основателей, потомство должно быть тщательно просеивают с помощью секвенирования на наличие благоприятной мутации с пищеварением анализы свидетельствуют лишь о том, что определено мутация присутствует.
Одно из критических замечаний часто высказывается против систем ZFN и Talen возможность того, что эти нуклеазы также способны расщеплять последовательности, присутствующие в другом месте в геноме, которые похожи на целевые сайты. Такие мимо ворот эффекты наблюдались с реагентами рано поколения используя домен гомодимерное Фоки, и гетеродимером конструкции были предназначены для облегчения и от ворот эффекты 25. Потенциальные вне сайты-мишени могут быть предсказаны в некоторой степени в кремнии 32,33 и отбор ПЦР и секвенирования. Очевидным преимуществом ое использованием ZFNs и Talens для генерации мышей, а не клеточных линий является возможность снятия мимо ворот мутации несвязанные до желаемой модификации генома, выполняя несколько беккроссов к штамма дикого типа выбора. Для анализа большого числа основателей мышей, следующего поколения глубокого секвенирования продуктов ПЦР, полученных от нуклеазы целевой локусе и в кремнии предсказанных мимо ворот локусы могут предложить альтернативный качественный и количественный считывания для расщепления анализах ПЦР-продуктов.
В вспомогательные репродуктивные методы, описанные в данном протоколе оптимизированы для стандартных линий мышей, используемых для микроинъекции экспериментов, таких как C57Bl/6J или B6D2F1. Мыши из различных источников, таких как беспородных штаммов, в принципе, может быть использован для редактирования геном подходов и может обеспечить более подходящий генетический фон для конкретных исследовательских вопросов. Производительность вспомогательных репродуктивных технологий, таких как суперовуляции может быть накладываемымиИДКТК по ряду штаммов 34-36, но может потребовать дальнейшей оптимизации нестандартных штаммов для того, чтобы получить достаточное количество эмбрионов для нуклеазы микроинъекции.
Кроме ZFN и Talen, новые дизайнерские нуклеазы, такие как РНК-направленной системы CRISPR/Cas9 9,37,38 уже были введены для редактирования генома приложений. Все методы микроинъекции и анализа учредителей животных, описанных здесь, также применимы к CRISPR/Cas9 и будущих режимов редактирования генома.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Monika Tarnowska, Корнелия Альбрехт и Ewa Skoczylas за отличную техническую помощь. Это исследование было профинансировано ОЯТ Синергия гранта CRSI33-125073 для ПП.
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |