당사는 양성 선택을 이용하여 살아있는 인간 배아 줄기세포(hESC)의 식별 및 농축을 위해 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 세포 표면 항원의 결합된 검출을 위한 단일클론 항체 TG30(CD9) 및 GCTM-2의 사용을 기술하고 또한 혼합세포 집단으로부터 hESC를 퍼지기 위한 음성 선택의 사용을 설명한다.
인간 배아 줄기 세포 (hESC)는 시험관 내에서무기한 으로 자가 갱신 할 수 있으며 적절한 큐를 사용하여 잠재적으로 모든 체세포 계보로 분화하도록 유도 될 수 있습니다. 분화 hESC 유도체는 잠재적으로 다양한 세포 퇴행성 질환을 치료하기 위해 이식 요법에 사용될 수 있습니다. 그러나, hESC 분화 프로토콜은 일반적으로 잔류 미분화 세포뿐만 아니라 분화 된 표적 및 오프 타겟 세포 유형의 혼합물을 산출한다. 실험실에서 클리닉으로 의 분화 된 hESC 유도체의 번역을 위해, 미분화 (다능성)와 분화 된 세포를 구별하고, 이러한 인구를 분리하는 방법을 생성 할 수 있어야합니다. hESC 유래 체세포 모형의 안전한 응용은 잔류 hESCs가 이식 다음 테라톰으로 알려져 있는 종양을 유도할 수 있기 때문에, 다능한 줄기 세포 없는 인구로만 달성될 수 있습니다. 이를 위해, 여기서우리는 양성 선택을 사용하여 능선 TG30 Hi-GCTM-2Hi hESCs의 식별을 위해 형광 활성 세포 분류(FACS)를 통해 단클론 항체 TG30(CD9) 및 GCTM-2를 이용한 흉부 관련 세포 표면 항원들을 검출하는 방법론을 설명한다. TG30/GCTM-2 FACS 방법론을 사용하여 매우 초기 단계 분화(TG30Neg-GCTM-2Neg)를겪고 있는 인구에서 미차별화 hESC를 감지하고 제거할 수 있었습니다. 추가 연구에서는 TG30/GCTM-2 FACS 프로토콜을 사용하여 선택된 분화TG30 Neg-GCTM-2Neg 세포의 만능 줄기 세포 없는 샘플은 면역 손상 마우스로 이식된 후 성소균을 형성하지 않아 프로토콜의 견고성을 뒷받침합니다. 한편, TG30/GCTM-2 FACS-농축 다능성 TG30 Hi-GCTM-2Hi hESC의 연속 패시징은 체외에서 자체 갱신하는 능력이나 본질적인 자발성 능력에 영향을 미치지 않았습니다. 따라서, TG30/GCTM-2 FACS 방법론의 특성은 분화 분석의 입력으로 hPSC의 고도로 농축된 인구를 얻고 유도체 세포 집단으로부터 잠재적으로 종양성(또는 잔류) hESC를 제거하는 민감한 분석법을 제공한다.
HPSC (hPSC)는 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 다능성 줄기 세포 (hIPSC)를 포함한다. HPSC는 “자발성”으로 알려진 능력을 잃지 않고 적절한 문화 조건에서 무기한 으로 자체 갱신할 수 있습니다. Pluripotency는 3개의 배아 세균 세포 층의 각각을 대표하는 세포를 포함하여 본질적으로 어떤 체세포 혈통으로 분화하는 세포에 대한 잠재력으로 정의됩니다. hPSC의 놀라운 잠재력은 치료 옵션을 포함한 다양한 세포 기반 응용 프로그램에 대한 수단을 제공합니다. 예를 들면, 심장 마비, 척추 상해, 당뇨병, 파킨슨 병, 몇몇 암 및 그밖 임상 병기에서와 같이, 인체에 있는 세포의 일반적인 기능이 손상되는 세포 죽음 및 변성을 관련시키는 무질서가 있습니다. 이러한 조건을 앓고 있는 환자는 실험실에서 hPSC에서 파생된 건강하고 기능적인 체세포 세포를 이식하여 잠재적으로 치료될 수 있었습니다. 그러나, 현재 hPSC 분화 프로토콜은 100% 효율적이지 않으며 분화된 표적 및 오프타겟 세포 유형뿐만 아니라 차별화를 거치지 않은 잔류 hPSC의 혼합물을 산출하여1-3을반복한다. 환자로 이식을 위한 hPSC 유래 체세포 샘플에서 소수의 hPSC의 존재는 3개의 배아 배아 층 의 조직을 형성하기 위하여 그들의 본질에 의하여 이 세포로 심각한 임상 리스크를 구성하고, 잠재적으로 기형종으로 알려져 있는 종양의 모형을 생체내에서 형성할 수 있었습니다. 따라서 만능 줄기 세포가 없는 것으로 판단된 표적 세포 집단만이 환자로 이식하는 데 안전하다고 간주될 수 있다. 잠재적으로 차별화 다음 잔류 hPSC의 정화를 달성하기 위해보고 된 몇 가지 방법이 있습니다(검토할 경우 Polanco 및 Laslett4참조). 우리는 이전에 다능성 줄기 세포를 식별하고 hESC 라인5-7의배양에서 분화의 초기 단계를 겪고 세포로부터 그들을 구별하기 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 결합 된 단일 클론 항체 TG30 (CD9) 및 GCTM-2의 사용을보고했다.
세포 표면 항원검출을 위해 항체를 사용하는 한 가지 장점은 표적 세포가 항체 결합 및/또는 라벨링 후에 일반적으로 실행 가능하다는 것입니다. 따라서, 표적 세포는 이식 전에 확장 및 추가 적용을 위해 항체 라벨링 후 수집및 재배양될 수 있다. hPSC에 발현된 세포 표면 항원에게 한 가지 주의사항은 다능성 단계에만 국한되지 않고 많은 경우에 발달 중에 일시적으로 다시 발현되어 있으며 따라서 일부 분화 된 세포 유형에서 검출될 것입니다. 따라서, 항체를 사용하여 인간 다능성 세포를 검출하고 hPSC 유래 세포의 샘플로부터 제거하는 것이 목적이라면, 선택된 항체도 이식을 위한 특정 분화 세포 유형에 항원과 반응해서는 안 된다. 불행히도, 라이브 hPSC 4에서세포 표면 마커를 검출하는 항체의 수가 제한되어 선택을위한 옵션이 제한적입니다. 또한, 몇몇 연구는 하나의 단일 세포 표면 마커의 검출이 모든 hPSC를 제거하기에 충분하지 않다는 것을 지적하고, 모든 hPSC 다능성 하위 집단을 제거하는 모든 시도는 hPSC 9-10에의해 표현된 상이한 에피토프를 검출하는 2개 이상의 항체를 사용하는 방법에 의존해야 한다는 것을 건의합니다. 위에서 언급했듯이, 만능 줄기 세포가 없는 세포 집단으로 결정될 수 있는 hPSC 유래 세포만이 인간 이식에 적합합니다. 이러한 수준의 스트링성에 도달하는 것은 항체 매개 세포 선별 기술을 통과하는 단일 패스로 달성되지 않을 수 있습니다. 분화 된 표적 세포의 농축 된 인구의 재문화 및 세포 분류의 후속 라운드는 결정적으로 다능성 줄기 세포없는 샘플을 얻기 위해 필요할 수 있습니다.
우리의 실험실에서, 우리는 광범위하게 살아있는 다능성 세포의 검출을 위한 2개의 hES 세포 표면 항체, TG30 (CD9) 및 GCTM-2를 특징으로 합니다. 우리의 연구는 TG30과 GCTM-2 둘 다의 결합된 검출이 hESC 라인 5-7에있는 정경 흉부 관련 유전자의 발현과 강하게 상관관계가 있다는 것을 보여주었습니다. TG30/GCTM-2 FACS 면역프로파일링은 hESC 배양이 TG30/GCTM-2 발현 5-7의정량적 연속 그라데이션을 구성한다는 것을 일관되게 보여주었다. 우리는 임의로이 TG30 / GCTM-2 그라데이션 내에서 세포의 네 개의 인구 (P)를 설립했다 : P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30낮은-GCTM-2낮은),P6 (TG30미드-GCTM-2미드)및 P7 (TG30 하이 -GCTM- GCTM 2)하이-GCTM2-7 하이트 – GCTM – 7. 이러한 P4, P5, P6 및 P7 세포 집단의 특성화는 P6 및 P7 과속이 많은 수의 흉부 관련 유전자를 발현하고 FACS 2-3이후의 재배양 시 줄기와 같은 식민지를 효율적으로 형성하는 것으로 나타났다. 한편, P4(TG30 Neg-GCTM-2Neg)세포는 많은 수의 분화 마커를 발현하고 hESC 라인의 배양 확대에서 전형적으로 발생하는 자발적으로 분화된 세포 유형을 구성한다 5-6. 우리는 초기 단계 분화 에 따라 잔류 hPSC의 선택적 제거에 대한 TG30 / GCTM-2 FACS의 잠재력을 테스트하기로 결정, 또한 다능성 줄기 세포 인구의 농축을 위해. 아래에 설명된 프로토콜은 다능성 P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)의제거를 달성하기 위해 FACS 이후의 분화 P4(TG30Neg-GCTM-2Neg)세포를 수집하고 재배양하는 방법을 보여줍니다. 또한, 다능성 P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)세포의 수집 및 재문화를 설명하여 다능성 세포의 농축 배양을 획득하여, 이는 그 후 정의된 입력 집단으로 사용될 수 있어 잠재적으로 분화 연구의 효율과 일관성을 증가시킬 수 있다.
임상 맥락에서, 분화된 체세포 유형은 이식 및 치료 응용을 위한 최종 바람직한 제품이며, hPSC는 실험실에서 그 체세포 또는 그들의 선조를 생성하는 자기 갱신 및 확장 가능한 근원입니다. 기종 형성에 대한 고유의 잠재력을 가진 잔여 미분화 hESC의 존재는 환자로 이식하기 위한 hESC 유래 체세포를 고려할 때 안전 위험입니다. 이 및 세포 치료와 관련 된 다른 위험의 검토에 대 한 Sharpe 외 를 참조 하시기 바랍니다. 16 그러한 응용 을 실현하기 위해 연구자들은 다능성 줄기 세포가없는 표적 세포 집단을 생성하는 것을 목표로하는 것이 필수적입니다. 이를 위해 TG30/GCTM-2 FACS 방법론을 사용하면 다능성 세포(TG30 Hi-GCTM-2Hi)의존재를 분화하는 세포 인구에서 모니터링하고 FACS 후 농축 및 재배양할 수 있는 실행 가능한 hESC 분화 유도체를 얻을 수 있음을 입증합니다. 우리의 프로토콜의 단일 패스로 100 % 만능 줄기 세포 없는 샘플을 얻을 수는 없지만, 농축 hESC 유도체는 재배양 될 수 있으며 연속 적으로 100 % 체세포 순도를 달성한다. FACS 이후 확장에 대한 체세포의 입증된 생존능력은 잠재적 이식 요법에 적합한 적절한 수의 세포의 생산을 가능하게 합니다.
이 파일럿 연구의 고무적인 결과는 몇몇 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (hiPSC) 선15를가진 비교 연구 결과에서 우리의 TG30/GCTM-2 프로토콜을 사용하여 보다 포괄적인 조사를 능력을 발휘하도록 자극했습니다. 그 연구에서, 우리는 우리의 TG30/GCTM-2 FACS 프로토콜을 사용하여 얻은 다능성 줄기 세포 없는 견본이 면역 박탈마우스로 이식될 때 성각을 생성하지 않았다는 것을 것을을 발견했습니다. 따라서, 우리는 자신있게 이 시험관 내 프로토콜의 사용으로, 다능성 TG30 Hi-GCTM-2Hi 세포가 생체 내에서 테라토마를 개발하지 않는 것으로 결정된 초기 단계 분화 세포 배양이 생체 내에서 테라토마를 개발하지 않는다는 것을 자신있게 밝힐 수 있다. 이것은 임상 응용 프로그램에서 hPSC 유래 세포를 사용하기 전에 기종 형성의 위험을 제거하는 잠재적 인 접근 법을 제공하는 분석의 견고성을 강력하게 지원합니다.
반대로, 우리는 또한 TG30/GCTM-2 FACS 분석이 이 두 표면 항원 (TG30 Hi-GCTM-2Hi)의높은 수준의 발현을 가진 다능성 세포 집단을 회수하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 이전 연구는 TG30Hi-GCTM-2Hi 세포가 OCT4hi 발현과 가장 높은 상관관계를 나타내고 hESC와 같은 콜로니5,6,13,15의가장 높은 수를 형성한다는 것을 보여주었습니다. 따라서 우리는 Pluripotency 네트워크가 TG30Hi-GCTM-2Hi 발현 셀의 최대 수준에서 활성화되는 것을 추론합니다. 우리는 TG30/GCTM-2 FACS 프로토콜을 사용하고 P7(TG30Hi-GCTM-2Hi)세포를 사용하여 분화 분석서에 대한 입력으로 농축 된 살아있는 hESC 배양을 대규모로 정화 할 수 있다고 생각합니다.
결론적으로, 우리는 hESC의 정화 및 농축 모두에 대한 표면 항원 TG30 및 GCTM-2의 결합 된 표현을 기반으로 FACS 어약의 잠재력을 여기에서 보여줍니다. hPSC의 지시된 분화를 위한 프로토콜을 가진 미래 연구는 또한 이 잠재력에 관하여 유익할 확률이 높습니다. 우리는 분화 된 hESC 유도체가 일시적으로 TG30 (CD9) 또는 GCTM-2를 발현하는 일부 분석서에서, 이 두 항체는 분석6의특정 시점에서 분화 된 인구로부터 다능성 세포를 제거하기에 적절하지 않거나 충분하지 않을 수 있음을 알고 있다. 따라서, 일부 분화 세포 유형과의 교차 반응의 가능한 한계를 극복하기 위해 살아있는 hESC를 구체적으로 인식하는 새로운 항체를 찾아야 할 필요성이 지속적으로 존재한다.
The authors have nothing to disclose.
모나쉬 대학의 StemCore 시설에서 hESC 라인과 모나시 대학의 FlowCore 시설 FACS 서비스를 제공해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 호주 줄기 세포 센터에서 연구 보조금에 의해 지원 되었다, 뉴 사우스 웨일즈와 빅토리아 정부 줄기 세포 연구 보조금 프로그램 모두에. ALL은 호주 줄기 세포 과학, 줄기 세포 호주에서 호주 연구 위원회 (ARC) 특별 연구 이니셔티브의 파트너 조사자입니다.
Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
Table 4. List of materials and reagent | |||
[header] | |||
FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
Table 5. List of equipment. |