利用单克隆抗体TG30和GCTM-2检测细胞表面抗原，促进人类胚胎干细胞的浓缩和清除

以下协议使用莫纳什大学（墨尔本）的 StemCore 设施提供的 hESC-MEL111 标准批量培养物执行。这个细胞系通常培养在bFGF补充的hESC/KOSR介质7 中一层不活化小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），并每5-7天8天用酶分离（拼贴酶）维持。hESC 培养物在 75 厘米2 （T75） 烧瓶中增长到约 80% 的汇合度，用作此协议的输入量。下文描述的所有细胞操作程序应在 HEPA 过滤的 II 类生物安全柜中在无菌条件下执行。 在执行 TG30/GCTM-2 FACS 检测的两天前，准备 T75 培养板（第 1 节中描述），用于对后 FACS 恢复的细胞进行再培养（第 4 节中描述）。 1. MEF 的播种和 MEF 条件介质的准备 1.1 天 -2： 将 MEF 镀入 T75 烧瓶 派珀特 10 毫升 0.1% w/v 明胶到每个 T75 烧瓶和倾斜到涂层表面均匀。 在室温下在生物安全柜中孵化 30 分钟。 吸气明胶溶液。 在细胞培养孵化器中加入 20 毫升 MEF 介质，在细胞培养孵化器中预平衡至 37 °C/5% CO2 30 分钟。 板在以下密度下，在准备好的烧瓶上断断续续地灭活 MEF。对于 1/3 MEF 密度种子 1.4 x 104 细胞/厘米2 （T75 = 1 x 106 MEF）。对于全密度 MEF 种子 5.3 x 104 细胞/厘米2 （T75 = 4 x 106 MEF）。 注意：我们经常使用被γ辐照而失活的 MEF。在米哈尔斯卡12号可以找到一个准备γ辐照的MEF的议定书。 在 37 °C/5% CO2 过夜孵化辐照 MEF 培养。1~3个烧瓶可以孵育1-4天，无需MEF中等变化。这些烧瓶用于重新镀上后 FACS 细胞（如协议 4 中）。完整的 MEF 烧瓶在一夜之间孵育，以便按照下面步骤 1.2 生成 CM。 1.2 天 -1： 准备 MEF 条件介质 （CM） 从全 MEF T75 烧瓶中吸气 MEF 介质。 添加预均衡 25 毫升 hESC/KOSR 介质，辅以 5 ng/ml 人类 FGF-2 每 T75 烧瓶。24 小时在 37 °C/5% CO2 中孵化。 将 MEF 调节介质 （CM） 收集到无菌组织培养管中，用 10 ng/ml 人类 FGF-2 新鲜补充 CM，使用 0.22 μm 聚醚硫酮过滤器进行过滤。 要生成额外的 CM，在一周内，每天重复同一 MEF 文化上的步骤 1.2.2 和 1.2.3。 在执行 TG30/GCTM-2 检测的当天，用 CM 替换 1/3 MEF T75 烧瓶中的 MEF 介质，并在播种从以下程序中恢复的任何 hESC 或 hESC 衍生细胞之前预平衡至少 30 分钟。CM 要么使用新鲜，要么存储在 4 °C 下长达 2 周。与非条件介质（未显示结果）相比，CM 在我们手中使用，它增加了 FACS 后细胞的生存能力。 2. 执行 TG30/GCTM-2 FACS 分析：将 hESC 批量培养物分离到单个单元格中 注意： 前丘尔 20% FBS/DMEM-F12 介质在 4 °C。 从两个带有培养 hESC 线的 T75 烧瓶中吸气 hESC/KOSR 介质。 用 10 毫升 DPBS 冲洗每个 T75 中的细胞，并吸气去除。 在每个 T75 烧瓶中加入 3 毫升 TrypLE 快速分离解决方案。孵化在37°C/5%CO2 5分钟。 凹凸烧瓶的侧面，以获得细胞的完全脱落。在显微镜下检查。如果细胞不容易分离，在37°C/5%CO 2下再孵育2-3分钟。 在每个 T75 烧瓶中加入 10 毫升 20% FBS/DMEM-F12（保持在 4 °C）。使用无菌的 10 毫升移液器将分离的细胞轻轻三次对烧瓶壁进行三次，以实现以单细胞为主的悬架。 将 70μm 细胞过滤器放在 50 毫升无菌聚丙烯管上。使用无菌的 10 毫升移液器，迫使从两个 T75 烧瓶中汇集的 hESC 单细胞悬架穿过过滤器。 丢弃电池过滤器，更换管盖，将池式 hESC 悬架在 1，000 x g 中离心机 2 分钟。 丢弃超自然物，通过在 10 毫升 20% FBS/DMEM-F12 中轻轻重新悬念颗粒（预制在 4 °C）来清洗细胞。 在 1，000 x g 下进行第二次离心，2 分钟。 丢弃超自然，加入10毫升20S/DMEM-F12（预制在4°C），轻轻三酯以补充细胞。将50毫升管放在冰上。此管将用于下面描述的 排序 样品 免疫染色程序。 使用血细胞仪计算细胞号，使用 hESC 单细胞悬架 （步骤 2.10） 的 20 μl 进行计数。您应该期望每 T75 烧瓶的产量为 1000 万至 1500 万个电池。 注意：FBS 用于协议的这一部分，以增加 FACS 后的细胞生存能力。 3. 细胞表面抗原TG30和GCTM-2的免疫荧光染色 将 hESC 单细胞悬架（从步骤 2.11）的 150 μl（约 100，000 个细胞）放入 6 个 1.5 毫升的微中微管中。这六个辅助报价将用于用于校准 FACS 机器上检测所需的染色控制。其余约9毫升细胞悬架将是您的排序样本，其中分离培养将成本检测TG30和GCTM-2，根据表1和2。 在 20% FBS/DMEM-F12 中执行 主要抗体 的结合反应。排序样本的最终反应量应为~9毫升，控件应为200 μl。将等型控制作为主要抗体。将管子水平放置在冰上，在摇动平台上轻轻混合30分钟。 离心机原抗体反应在1，000 x g为2分钟。 丢弃超纳特，通过将颗粒重新悬念在 20 毫升 20% FBS/DMEM-F12（预制在 4 °C）中用于排序样本和 200 μl 用于对照组，从而清洗细胞。 在 1，000 x g 下进行第二次旋转 2 分钟。 在 20% FBS/DMEM-F12 中执行 二次抗体 的结合反应。排序样本的最终反应量应为 2.5 毫升，控件应为 200 μl。在此阶段准备PE防鼠标CD90.2反应管。将管子水平放置在冰上，在摇动平台上轻轻混合30分钟。 注意：在此孵化期间，收集CM并准备 1/3 MEF T75 烧瓶（如第 1.2 节）。 离心机二次抗体反应在1，000 x g为2分钟。 丢弃超自然物，通过在 20 毫升 20 毫升 20% FBS/DMEM-F12（预制在 4 °C） 中的颗粒和 200 μl 的对照组中清洗两次细胞。 每次洗涤后，在 1，000 x g 处旋转 2 分钟，并将管子放在冰上。 在 20% FBS/DMEM-F12 中丢弃超纳特并重新喷出细胞颗粒，并以 0.3μg/ml 的速度补充碘化物 （PI）。使用 2-3 毫升的排序样本和 300 μl 的控件。 注意：不要将 PI 添加到带未染色细胞的控制管中。 使用 P1000 微皮，通过 35 μm 盖子细胞过滤器强制每个单元格悬架，并耦合到 5 毫升管聚苯乙烯圆形底部试管。 离心机在50克/分钟，迫使通过残余细胞悬浮在过滤器盖上。 通过敲击管的两侧，并放置在冰上，恢复每个单元格悬架。您的细胞现在已准备好使用 FACS。请立即出发。 4. 75 厘米 2 （T75） 火焰中的 TG30/GCTM-2 子折射单元的后 FACS 培养 我们以前曾报告过如何为TG30/GCTM-2免疫扩散7建立一个FACS机器。该程序允许恢复可行的单 HESC，没有 MEF，并在 P4 （TG30Neg-GCTM-2Neg）的大门内， P5 （TG30低- GCTM-2低）， P6 （TG30中- GCTM-2中） 和 P7 （TG30Hi- GCTM-2喜） – 见 图 1E。设置 TG30/GCTM-2 FACS 的 FACS 机器，就像我们之前的报告中一样，以恢复接下来使用的单元子字体。 在从 FACS 机器收集细胞之前，在两个 5 毫升聚苯乙烯圆形底部试管中加入 1 毫升 CM，按步骤 1.2 进行制备。放在冰上。 使用 TG30/GCTM-2 FACS 从分化 P4 （TG30Neg-GCTM-2Neg）和多能 P7 （TG30Hi-GCTM-2Hi）细胞子解体中各恢复 400，000 个细胞。 以 1，000 x g 的速度将收集管离心 5 分钟。 吸气超人。加入 1 毫升预平衡 37 °C/5% CO2 CM，使用 P1000 微管来补充每个细胞颗粒。将每个分数的细胞播种到预平衡的 1/3 MEF T75 烧瓶上，并使用 CM（按步骤 1.2 准备） 在细胞培养孵化器中，24 小时内的 37 °C/5% CO 2 培养。 每天吸气CM，代之以新准备的CM（如步骤1.2），持续约两周。多能P7（TG30 Hi-GCTM-2Hi）细胞的培养在一周后显示人类干细胞状的菌落，并在9-11天内达到+80%的汇合。P4（TG30 Neg-GCTM-2Neg）细胞的培养大多生长成成纤维细胞状细胞的草坪，在11-13天内达到共融。在此阶段，如果需要，P4 和 P7 细胞培养可用于 TG30/GCTM-2 FACS 调解 P4 或 P7 子折片的连续再造（见图 2和3）。