מדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. כאן אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת קביעת GFR בעכברים מודעים באמצעות זריקה אחת בולוס, קביעת isothiocyanate ההעמסה (FITC)-אינולין בפלזמה וחישוב GFR ידי מודל דעיכה מעריכית שני שלבים.
המדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. נכון לעכשיו, חוקרים לקבוע GFR על ידי מדידת רמת קריאטינין הסמן הביולוגי אנדוגני או יישומי רדיואקטיבי אינולין שכותרת exogenously (3 H או 14 ג). יש קריאטינין חסרון המשמעותי שהחשבונות טובולרית הפרוקסימלי ל~ 50% מהפרשת קריאטינין כליה מוחלטת ולכן קריאטינין לא GFR סמן אמין. בהתאם לניסוי שבוצע, ניתן לקבוע אישור אינולין ידי הזרקה תוך ורידית או בולוס יחידה עירוי מתמשך (minipump תוך ורידית או האוסמוטי). שתי הגישות דורשות אוסף של פלזמה או פלזמה ושתן, בהתאמה. חסרונות אחרים של אינולין שכותרתו רדיואקטיבית כוללים שימוש באיזוטופים, זמן רב הכנה כירורגית של בעלי החיים, ואת הדרישה של ניסוי מסוף. כאן אנו מתארים שיטה שבה משתמשת בזריקת בולוס בודדת שלisothiocyanate-(FITC) אינולין שכותרת והמדידה של הקרינה שלה ב1-2 μl של פלזמה דילול והעמסת. על ידי יישום מודל דו תא, עם 8 אוספי דם לכל עכבר, ניתן למדוד GFR בעד 24 עכברים ליום באמצעות פרוטוקול זרימת עבודה מיוחד. שיטה זו דורשת הרדמה isoflurane קצרה עם כל דגימות הדם שנאספו בעכבר הלא מרוסן וער בלבד. יתרון נוסף הוא שאפשר לעקוב אחרי עכברים על פני תקופה של מספר חודשים וטיפולים (כלומר עושה ניסויים לזווג עם שינויים תזונתיים או יישומי סמים). אנו מקווים כי טכניקה זו של המדידה GFR היא שימושית לחוקרים אחרים הלומדים בתפקוד כליות עכבר ותחליף שיטות פחות מדויקות של הערכת תפקוד כליות, כמו פלזמה וחנקן האוריאה קריאטינין בדם.
קצב היווצרות של הפלזמה ultrafiltrate בglomerulus הפך בסיס להערכת תפקוד כליה (קצב סינון גלומרולרי, GFR). הסמן האידיאלי כדי לקבוע GFR צריך להיות מסונן באופן חופשי, לא מופרש או נספג מחדש ולא עובר מטבוליזם. כגון התנהגות נמצאה להיות אמיתי לאינולין, ואישור אינולין הפך סטנדרט זהב לקביעת GFR 3. ואילו אישור של קריאטינין נעשה שימוש נרחב כאמצעי של GFR בבני אדם ובעלי חיים, קריאטינין לא למלא את הדרישות של סמן GFR אידיאלי. בסביבות 10 – 40% מפינוי קריאטינין בבני האדם הוא התוצאה של הפרשה טובולרית פעילה 1, 11, ואת הפרשת כליות של קריאטינין היא גם בולטת בעכברים וחולדות 4, 7, 9, 22. פגיעת כלייתית ידועה להגדיל את הפרשת צינורי של קריאטינין אשר מגבילה את הערך שלו כסמן של 1 GFR, 2. אנחנו הראינו כי איזופורם טרנספורטר אניון האורגני בעבר3 (OAT3) תורם להפרשת קריאטינין כליות עכברית 22. עם זאת, בדרך כלל דורש אישור אינולין השימוש באינולין שכותרתו רדיואקטיבית (3 H או 14 ג). נחישות רדיואקטיבית של אינולין יכולה לשמש גם בעכברים מורדמים ומודעים, אבל מטפחת את החסרונות של תקנות בטיחות רבות וסוגיות טיפול מחמירות הגלומות בשימוש באיזוטופים רדיואקטיביים. לאורך שורות אלה, הכנות לפינוי כירורגיות קביעת GFR הן זמן רב, כמו גם מסוף בטבע. בשנת 1999 לורנץ ואח'. הציג 12 FITC-אינולין כסמן של אחת נפרון GFR בעכברים מורדמים. חמש שנים לאחר מכן צ'י et al. נקבע 15 כל הכליה GFR בעכברים מודעים באמצעות FITC-אינולין. פרוטוקולים אלטרנטיביים כיום באמצעות FITC-אינולין כסמן אקסוגני למדוד GFR בעכברים מודעים ומורדמים. פרוטוקולים אלה לשמר את הרגישות של אינולין רדיואקטיבי באמצעות הקרינה detectiובעקיפה על החסרונות של עבודה עם סמן מסומן רדיואקטיבית. Assay FITC-אינולין שונה על ידי אחרים 7, 8 ו 22, 23 לנצל את היכולת של microvolume 3300 fluorospectrometer NanoDrop. זה מאפשר להקטין את נפח הדגימה הכולל דרוש ל< דם μl 100 לGFR מדידה.
עם השיטה ופרוטוקול העברת נתונים גבוה סיפק בפרסום זה, אנחנו מדגימים את היתכנות המדידה GFR בעד 24 עכברים מודעים ליום. טכניקה זו יכולה להיות שימושית לחוקרים אחרים הלומדים GFR העכברי ואנו מקווים שהוא יחליף את שיטות פחות מדויקות ככל מדדים לתפקוד כליות, כגון קריאטינין וחנקן אוריאה בדם.
המחקר הנוכחי מתאר טכניקה לקביעת GFR בעכברים בהכרה בזריקה חד בולוס וניתוח של הקרינה ב8 דגימות דם על ידי דעיכה מעריכית שני שלבים. מדידת GFR בעכבר 1 לוקחת 75 דקות. באמצעות תרשים זרימה מיוחד, ניתן למדוד את GFR של 6 עכברים ב -130 דקות. זה ריאלי לחזור על פרוטוקול זרימת תרשים זה עד 4 פעמים ביום ולמדוד GFR ב24 עכברים. אנחנו שונה בשיטה זו, כך שניתן לאסוף את הדם מחיתוך זנב קטן ולא לנקב וריד זנב, שהוא מהיר וקל יותר לחוקרים לבצע השוואה לנקב וריד זנב. באמצעות 10 μl המטוקריט נימים ודילול 1:10, ניתן להפחית את הסכום הכולל של דם לצורך <100 μl. לבסוף, הקרינה נמדדת באמצעות 3300 fluorospectrometer NanoDrop, המאפשר קביעת הקרינה ב1-2 μl של מדגם בדילול מלא. שיטה זו תיתן לי investigato מעונייןערך GFR האמיתי RA. בניגוד לכך, יש לי מדידות קריאטינין בעכברים כמה חולשות, כולל "מגוון עיוור קריאטינין" וקשיים הקשורים לקביעה ספציפית ורגישה. "מגוון העיוור קריאטינין" מגביל את תפקודו כסמן לGFR משום הסרום קראטינין נשאר בטווח הנורמלי עד 50% מתפקוד כלייתי הוא איבד 19. מאז כמה חוקרים להשתמש בעכברים מהונדסים גנטי במחקר שלהם ללימוד פיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה כליות, זה נושא את הבעיה הבאה: בהנחת שעכבר בנוקאאוט של X גנים תצטרך GFR נמוך באופן משמעותי (ב -40%) בהשוואה לעכבר פראי סוג, הקרנה על ידי השוואה פשוטה הפלזמה קריאטינין לא לזהות את ההבדל הזה. הצורך בשיטה מדויקת טובה של נחישות GFR הופך להיות קריטי יותר קטן יותר את ההבדלים בGFR להיות.
יש עכברי ריכוזים גבוהים של chromagens הלא קריאטינין בפלזמה ובשתן שלהם שמפריעים מסחרימבחני קריאטינין זמינים. כתוצאה מכך, מבחני המבוססים על ריכוז אלקליין picrate יפה תגובת אומדן היתר קריאטינין בפלזמה בהשוואה לביצועים גבוהה כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) 6 נחישות, 13. מגבלה נוספת היא שקריאטינין הוא מתחת מגבלות זיהוי של כמה מבחני זמינים מסחרי בהשוואה לנחישות HPLC. עם זאת, על ידי שימוש בחוקרי תגובות אנזימטיות הצליחו לקבוע הפלזמה קריאטינין ב10 עכברים, 22.
GFR בטווח דומה נמצאו בעכברים בהכרה בשיטה דומה חד בולוס הזרקה, כמו גם אישור FITC-אינולין 14 שתן. בניגוד לפרוטוקול שלהם, הפרוטוקול שלנו באמצעות חיתוך זנב אינו דורש אמצעי זהירות מיוחד כדי לשמור על שלמות הכלי בהשוואה לוריד זנב או לנקב וריד saphenous. לאישור שתן / פלזמה מבוססת FITC-אינולין יש צורך להשתיל שני ק"מ האוסמוטי בניתוחnipumps. שתי משאבות הן הכרחיים כדי להשיג ריכוזים גבוהים מספיק מצב יציב פלזמה FITC-אינולין שהם בבירור להבחין מהרקע. הדבר מחייב גם את השימוש בכלובים מטבוליים לאיסוף שתן מלא ומתוזמן. הכלובים צריכים להיות שטף לחשבון להפסד של 25-37% מFITC-אינולין, אשר אחרת מתרחש ללא שטיפה.
את החסרונות של שימוש בשיטת FITC-אינולין זה מוגבלים. חוקרים צריכים להיות מודעים את הדברים הבאים: (i) להבטיח כי אין בועות אוויר במזרק המשמש להזרקה של FITC הפתרון, חייבת להיות מושגת (ii) הזרקת retrobulbar מלאה משום שהכמות המוזרקת קובעת GFR מחושב, ו( iii) עכברים להשתין הסביר ביותר במהלך ניסוי 75 דקות GFR, כך למנוע זיהום דגימות דם עם שתן, שיש לי ריכוז FITC-אינולין גבוה מאוד כתוצאה של יכולת ריכוז הכליות.
o יתרונות כללייםF-שיטת FITC אינולין זה כוללת את הפעולות הבאות: (א) היא טכניקה לא רדיואקטיבי, (ii) ניתן לחזור על מדידות מספר פעמים באותו העכבר, (iii) assay יכול להתבצע בעכברים בהכרה, ( ד) אין צורך באיסוף שתן, ו( V) יכולה להיות מנוצל אפשרות תפוקה גבוהה. חסרונות להזרקת בולוס אחת כוללים את הצורך בדיאליזה של FITC-אינולין, שניתן להתגבר על ידי שימוש בFITC-סמן טוב יותר, FITC-sinistrin, שזמין כעת וניתן למדוד transcutaneously באמצעות מכשיר מיוחד 18 מיניאטורי. למרות GFR נמדד, לא ניתן למדוד את ההפרשות חלקיות של נוזל או יונים בשיטה זו.
יחדיו, בשיטה זו מספקת את הכדאיות של שיטת תפוקה גבוהה למדידת GFR בעכברים בהכרה. לכן, טכניקה זו עשויה להיות עניין לחוקרים אחרים המתעניייינים בקביעת תפקוד כליה בעכברים.
The authors have nothing to disclose.
אני מודה לד"ר ג'סיקה דומינגז Rieg לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד לב האמריקאי (מדען פיתוח גרנט 10SDG2610034), קרל וו גוטשלק מענק מחקר של האגודה האמריקנית לנפרולוגיה, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות או 'בריין למרכז אקוטי פגיעה מחקר בכליות ( P30DK079337), והמחלקה לענייני יוצאי צבא.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Yorumlar |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |