قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) هو المعيار الذهبي لتقييم وظائف الكلى. هنا نحن تصف طريقة الإنتاجية العالية التي تسمح بتحديد GFR في الفئران واعية باستخدام حقنة واحدة بلعة، وتحديد فلوريسئين ثيوسيانات (FITC)، حبوب في البلازما وحساب GFR بواسطة نموذج الاضمحلال الأسي على مرحلتين.
قياس معدل الترشيح الكبيبي (GFR) هو معيار الذهب في تقييم وظائف الكلى. حاليا، محققين تحديد GFR عن طريق قياس مستوى الكرياتينين العلامات البيولوجية الذاتية أو خارجيا التطبيقية المشعة صفت حبوب (3 H أو 14 C). الكرياتينين لديه عيب كبير أن الداني حسابات إفراز أنبوبي ل~ 50٪ من إجمالي إفراز الكرياتينين الكرياتينين كلوي وبالتالي ليس GFR علامة موثوق بها. اعتمادا على تجربة أداء، يمكن تحديد إزالة حبوب عن طريق حقن بلعة واحدة في الوريد أو التسريب المستمر (minipump في الوريد أو ناضح). كلا النهجين يتطلب جمع البلازما أو البلازما والبول، على التوالي. وتشمل العوائق الأخرى المشعة حبوب صفت استخدام النظائر، مضيعة للوقت إعداد الجراحية للحيوانات، واشتراط وجود تجربة محطة. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يستخدم حقن بلعة واحدة منفلوريسئين ثيوسيانات-(FITC) حبوب وصفت وقياس مضان في 1-2 ميكرولتر من البلازما المخفف. عن طريق تطبيق نموذج اثنين من المقصورة، مع 8 مجموعات الدم في الماوس، فمن الممكن لقياس GFR في ما يصل الى 24 فئران لكل يوم باستخدام بروتوكول تدفق العمل الخاص. هذا الأسلوب يتطلب سوى تخدير isoflurane وجيزة مع جميع عينات الدم التي يتم جمعها في الماوس غير مقيدة ومستيقظا. ميزة أخرى هي أنه من الممكن لمتابعة الفئران على مدى فترة من عدة أشهر والعلاجات (أي القيام بتجارب إرفاقها مع التغييرات الغذائية أو التطبيقات المخدرات). نأمل أن هذا الأسلوب من قياس GFR هو مفيد للمحققين الأخرى دراسة وظائف الكلى الماوس وسوف تحل محل أساليب أقل دقة من تقدير وظائف الكلى، مثل البلازما الكرياتينين واليوريا والنيتروجين في الدم.
أصبح معدل تشكيل البلازما رشاحة مستدقة في الكبيبة أساس لتقييم وظائف الكلى (معدل الترشيح الكبيبي، GFR). علامة مثالية لتحديد GFR ينبغي تصفيتها بحرية، لا يفرز أو استيعابها وليس استقلابه. تم العثور على مثل هذا السلوك أن يكون صحيحا لحبوب، وأصبحت إزالة حبوب معيار الذهب لتحديد GFR 3. في حين يتم استخدام إزالة الكرياتينين على نطاق واسع كمقياس للGFR في البشر والحيوانات، والكرياتينين لا يلبي متطلبات من GFR علامة مثالية. حوالي 10 – 40٪ من تصفية الكرياتينين في البشر هو نتيجة لإفراز أنبوبي بالموقع 1، 11، وإفراز الكلوي من الكرياتينين هو أيضا بارزة في الفئران والجرذان 4، 7، 9، 22. ومن المعروف الكلى اختلال وظيفي لزيادة إفراز أنبوبي من الكرياتينين مما يحد من قيمتها كعلامة من GFR 1، 2. لقد أظهرنا سابقا أن العضوية أنيون الإسوي نقل3 (OAT3) يسهم في إفراز الفئران الكرياتينين كلوي 22. ومع ذلك، وإزالة حبوب يتطلب عادة استخدام المشعة صفت حبوب (3 H أو 14 C). تحديد المشعة من حبوب يمكن استخدامه في كل من الفئران تخدير واعية، ولكن تؤوي مساوئ عديدة لوائح السلامة والتعامل مع قضايا صارمة متأصلة مع استخدام النظائر المشعة. على طول تلك الخطوط، والأعمال التحضيرية إزالة الجراحية لتحديد GFR هي مضيعة للوقت وكذلك محطة في الطبيعة. في عام 1999 لورينز وآخرون. 12 قدم FITC-حبوب كعلامة من واحد كليون GFR في تخدير الفئران. خمس سنوات بعد الانعقاد تشى وآخرون. 15 تحديد كامل GFR الكلى في الفئران واعية باستخدام FITC-حبوب. بروتوكولات بديلة تستخدم الآن FITC-حبوب باعتباره علامة خارجية لقياس GFR في الفئران واعية وتخدير. هذه البروتوكولات الإبقاء على حساسية حبوب المشعة باستخدام مضان detectiعلى التحايل وعيوب العمل مع علامة مشعة المسمى. تم تعديل مقايسة FITC-حبوب من قبل الآخرين 7 و 8 و لنا 22 و 23 للاستفادة من القدرة microvolume من معمل NanoDrop 3300 fluorospectrometer. وهذا يسمح تخفيض مجموع حجم العينة المطلوبة ل<100 ميكرولتر من الدم في قياس GFR.
مع أسلوب وبروتوكول الإنتاجية العالية المقدمة في هذا المنشور، ونحن لشرح جدوى قياس GFR في ما يصل الى 24 الفئران واعية لكل يوم. هذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة للمحققين آخرين يدرسون GFR الفئران، ونحن نأمل أن تحل محل أساليب أقل دقة مؤشرين لوظائف الكلى، مثل الكرياتينين واليوريا والنيتروجين في الدم.
يصف هذه الدراسة تقنية لتحديد GFR في الفئران واعية من قبل حقن بلعة واحد وتحليل مضان في 8 عينات الدم عن طريق مرحلتين الاضمحلال الأسي. A قياس GFR في 1 الفأر يأخذ 75 دقيقة. باستخدام الخاصة لوحة المجريات، فمن الممكن لقياس GFR من 6 الفئران في 130 دقيقة. فمن الممكن أن يكرر هذا البروتوكول تدفق الرسم البياني يصل إلى 4 مرات في اليوم الواحد وقياس GFR في 24 الفئران. نحن تعديل هذه الطريقة حتى أنه من الممكن لجمع الدم من قص ذيل صغير بدلا من ذيل ثقب الوريد، والتي هي أسرع وأسهل للمحققين لإجراء مقارنة مع ذيل ثقب الوريد. باستخدام 10 ميكرولتر الهيماتوكريت الشعيرات الدموية والتخفيف 01:10، فمن الممكن للحد من المبلغ الإجمالي من الدم اللازم ل<100 ميكرولتر. وأخيرا، يتم قياس مضان باستخدام معمل NanoDrop 3300 fluorospectrometer، الذي يسمح بتحديد مضان في 1-2 ميكرولتر من العينة المخففة. وهذه الطريقة سوف تعطي محقق المهتمةصحيح را قيمة GFR. في المقابل، قياسات الكرياتينين في الفئران لديها العديد من نقاط الضعف بما في ذلك "مجموعة أعمى الكرياتينين" والصعوبات المتعلقة بتحديد محددة وحساسة. في "مجموعة أعمى الكرياتينين" حدود وظيفتها كعلامة للGFR بسبب مصل الكرياتينين يبقى في المعدل الطبيعي حتى يتم فقدان 50٪ من وظيفة الكلى 19. منذ عدة محققين استخدام الفئران المعدلة وراثيا في أبحاثهم لدراسة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية الكلوية، وهذا يحمل المشكلة التالية: وعلى افتراض ماوس خروج المغلوب من الجينات X لديها GFR أقل من ذلك بكثير (بنسبة 40٪) مقارنة مع الماوس من النوع البري، وهو وفحص بسيط بمقارنة البلازما الكرياتينين لا يكشف هذا الاختلاف. الحاجة إلى وجود طريقة دقيقة جيدة من GFR تقرير يصبح أكثر أهمية أصغر الفوارق في GFR تصبح.
الفئران لديهم تركيزات عالية من chromagens غير الكرياتينين في البلازما والبول التي تتداخل مع تجارياالمقايسات الكرياتينين المتاحة. ونتيجة لذلك، المقايسات التي تستند إلى جافيه تتجمع القلوية رد الفعل المبالغة تركيز الكرياتينين في البلازما مقارنة مع عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) تحديد 6 و 13. الحد الآخر هو أن الكرياتينين في مصل الدم هو أقل من حدود الكشف عن عدة فحوصات متوفرة تجاريا مقارنة HPLC تقرير. ومع ذلك، باستخدام التفاعلات الإنزيمية المحققين تمكنوا من تحديد البلازما الكرياتينين في الفئران 10، 22.
تم العثور على GFR في مجموعة مشابهة في الفئران واعية باستخدام أسلوب حقن بلعة واحدة قابلة للمقارنة وكذلك البولية التخليص FITC-حبوب 14. وعلى النقيض من البروتوكول، وبروتوكول لدينا باستخدام قص ذيل لا يتطلب احتياطات خاصة للحفاظ على سلامة السفينة بالمقارنة مع الوريد الصافن الذيل أو ثقب الوريد. عن التخليص البولية / بلازما استنادا FITC-حبوب فمن الضروري لزرع جراحيا اثنين ميل ناضحnipumps. مضختين ضرورية لتحقيق عالية بما فيه الكفاية الحالة المستقرة البلازما تركيزات FITC-حبوب التي يمكن تمييزها بوضوح من الخلفية. وهذا يتطلب أيضا استخدام الأقفاص الأيضية لجمع البول الكامل وتوقيتها. تحتاج الأقفاص إلى أن تشطف لحساب خسارة من 25-37٪ من FITC-حبوب، والذي يحدث خلاف ذلك دون الشطف.
مطبات باستخدام هذا الأسلوب FITC-حبوب محدودة. ينبغي للمحققين أن تكون على علم بما يلي: (ط) أؤكد أنه لا توجد فقاعات الهواء في الحقنة المستخدمة للحقن للحل FITC، يجب أن يتحقق (II) الحقن خلف المقلة كاملة لأن كمية حقن يحدد GFR محسوب، و ( III) الفئران فإن معظم التبول المرجح خلال دقيقة التجربة GFR 75، لذا تجنب تلويث عينات الدم مع البول، والتي سيكون لها تركيز FITC-حبوب عالية جدا نتيجة لقدرة تركيز الكلى.
مزايا عامة سو هذا الأسلوب FITC-حبوب تتضمن ما يلي: (ط) وهي تقنية غير المشعة، (الثاني) أنه من الممكن تكرار القياسات عدة مرات في نفس الماوس، (الثالث) الفحص لا يمكن أن يؤديها في الفئران واعية، ( رابعا) لا يلزم جمع البول، و(V) خيار الإنتاجية العالية يمكن استخدامها. وتشمل مساوئ لحقن بلعة واحد الحاجة لغسيل الكلى من FITC-حبوب، والتي يمكن التغلب عليها باستخدام أفضل FITC-علامة، FITC-sinistrin، والذي يتوفر الآن، ويمكن أن يقاس transcutaneously باستخدام جهاز المنمنمة الخاصة 18. على الرغم من GFR يقاس، فمن غير الممكن قياس إفرازات كسور من السوائل أو الأيونات مع هذا الأسلوب.
أخذت معا، ويوفر هذا الأسلوب جدوى أسلوب الإنتاجية العالية لقياس GFR في الفئران واعية. وبالتالي، هذه التقنية قد تكون ذات فائدة للمحققين آخرين يرغبون في تحديد وظيفة الكلى في الفئران.
The authors have nothing to disclose.
أشكر الدكتور جيسيكا دومينغيز Rieg لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (عالم التنمية المنحة 10SDG2610034)، وكارل جورج جوتشالك بحوث المنح للجمعية الأمريكية لأمراض الكلى، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى مركز أوبراين للأبحاث إصابة الكلى الحاد ( P30DK079337)، وزارة شؤون المحاربين القدامى.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Yorumlar |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |