Viral vektörler hedefli gen manipülasyonu için izin verir. Bu arka boynuzu içine, bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon, birincil somatosensoriyel afferentleri ve merkezi sinir sistemi nöronları arasındaki sinaptik bir temas önemli yer kullanılarak, koşullu gen ekspresyonu ya da fare omurilik ablasyonu için bir yöntem göstermektedir.
Bir viral vektörün intraparankimal enjeksiyon nöronlar ya da merkezi sinir sisteminin belirli bölgelerinde farklı popülasyonlarda şartlı gen manipülasyonu sağlar. Biz fare omurilik dorsal boynuz hedeflenen gen ekspresyonu veya susturulması sağlayan bir stereotaksik enjeksiyon tekniği göstermek. Cerrahi prosedür kısa. Bu hayvan ve omurganın uğramamış motilite hızlı kurtarma sağlayan, tek vertebra laminektomi gerektirir. Eğimli cam kanül ile mikroenjektör düşük hız ve kullanım küçük bir vektör süspansiyon hacmi Kontrollü enjeksiyonu doku lezyonu aza indirmek. Vektör lokal bağışıklık cevabında istihdam virüs içsel özelliklerine bağlıdır; bizim deneyim, bir rekombinant adeno-ilişkili virüs kullanıldığında küçük ve kısa sürelidir. Bu tür gelişmiş yeşil floresan proteini gibi bir raportör gen vektör izlenmesi uzaysal dağılımının kolaylaştırır ve etkinliği ve hücresel specitransfeksiyon özgüllük.
Fare koşullu gen manipülasyonu Gelişmiş teknolojiler merkezi sinir sisteminde sinaptik yollar ve fonksiyonel bağlantılarının araştırılması için çok yönlü yaklaşımlar sağlar. Transgenlerin östrojen reseptör 1 mutasyona uğramış bir ligand-bağlayıcı etki tanıyan bir repressör veya gen transkripsiyon aktivatörü veya tamoksifen gibi çalışması için dizayn edilebilir bir tetrasiklin kontrollü Transaktivatörü, hareket gibi doksisiklin gibi küçük moleküllü etkileyiciler tarafından düzenlenebilir . Tersinmez transgen değişiklik yaygın deoksiribonükleik asit (DNA) rekombinaz tarafından elde edilir. Cre (nedenleri rekombinasyon) ve FLP (flippase rekombinasyon enzim) eksizyonu, inversiyon veya sırasıyla 1 loxP (crossing x odağı üzerinde, P1) veya Frt (flippase tanınması hedef) siteleri tarafından kuşatılmıştır DNA parçalarının translokasyon katalize. Uygulamalar gen aktivasyonu veya susturulması ve indüklenebilir ribonükleik asit (RNA) girişime dahil <sup> 2. Bu tür β-galaktosidaz, alkalin fosfataz ya da enzimatik olarak floresan muhabir Koşullu ifade nöronlar etiket ve bunların topikal organizasyon ve bağlantı 3 incelemek için kullanılabilir. Kuzey Amerika (Büyük ölçekli mutajenez projeler http://www.norcomm.org/index.htm ) ve Avrupa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) ile fare embriyonik kök hücre klonlarının kütüphaneleri üretiyoruz sonunda tüm fare genomuna kapsayacak koşullu gen hedefleri ve tuzaklar. Bu klonlar elde Fare seçici gen manipülasyonu için nöronların belirli bir nüfus (özel yararlanıcılar veya lokus altında DNA rekombinaz ifade o fare hatları genişleyen bir sayı ile geçilebilir http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> Ancak, nöronların veya ilgi belirli bölgelerde ayrı nüfus gen manipülasyonu kısıtlayan genetik ilgi nöron topluluğuna özgü bir organizatörü bilinir değilse yalnız hedefleme veya bölgedeki bütün nöronlar tarafından ifade değil elde edilemez ilgi. Spinal kord, deneysel tasarımlar bir veya iki kraniokaudal kesimlerine gen manipülasyonu mekansal kısıtlanması gerekebilir. Cre veya FLP ifade eden bir viral vektör Stereotaksik enjeksiyonu floxed veya flrted alel denilen, DNA parçalarının loxP veya Frt siteleri tarafından çevrili olduğu farelerde omurilik bölgelere gen rekombinasyon sınırlanmasını sağlayan. Bünye DNA düzenlenmesi aksine, hangi Rekombinaz ifade fare ile melezleme hayvanlardan neden olur, bu strateji aynı zamanda gen aktivasyonu veya susturulması üzerinde zamansal kontrol sağlar. Kodlama Viral vektörler floxed veya transgenlerin correspo ifade farelerde gen manipülasyonu bir ters seçeneği sunuyoruz flörtBir nöron spesifik promotör Rekombinaz aşağı nding. Nöronlara afinite ile Çeşitli rekombinant vektörler 4 mevcuttur. Yüksek kapasiteli (korkak) adenovirüs, adeno-ilişkili virüs, herpes simpleks virüsü ve lentivirüs yaygın nörotropik vektörler kullanılır. Bir araştırma sorusu için uygun olan virüs seçilmesi deneysel tasarım çok önemli bir parçasıdır. Transgen büyüklüğü, doğum şekli, inflamatuar ve toksik yan etkileri 4 düşünülmesi gereken glial hücreleri, enfeksiyon etkinliği, aksine nöronlara enfeksiyon özgüllüğü.Burada omurilik dorsal boynuz, biz ağrı nörobiyoloji üzerine araştırma koşullu gen regülasyonu için kullandıkları bir tekniktir bir viral vektör stereotaksik enjeksiyon tarif. Dorsal boynuz nosiseptif nöronlar da dahil olmak üzere birincil somatosensoriyel nöronlardan gelen afferent girdi alır. Projeksiyon nöronları onu ifade etmeden önce yerel internöron bilgi işlembeyin 5 dorsal boynuz. Biz yapısal olarak aktif sitomegalovirüs organizatörü altında arttırılmıştır yeşil flüoresan protein (eGFP) ifade eden bir nörotropik rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) ile spinal segmental seviyede L4 dorsal boynuz nöron enfeksiyonu gösterir.
Stereotaksik vektör enjeksiyon, nörodejenerasyon 11 önlenmesi veya tedavisi için yaralanma 9,10, veya gen tedavisi rejenerasyon sırasında 6,7 veya optogenetic disseksiyon 8, akson kılavuz yayılan virüs transsinaptik dayalı bu tür nöronal ağ eşleme gibi uygulamalar için, omurilik nöronları hedefleme sağlar 12. Viral vektörler somatosensoriyel, motor ve otonomik yolların 9,10,13-15 çalışma omurilikte gen manipülasyonu içi…
The authors have nothing to disclose.
Biz teknik yardım için Bakhos A. Tannous, Ph.D., rAAV-eGFP vektör bize sağlamak için Massachusetts Genel Hastanesi, Charlestown, Massachusetts, Nörobilim Merkezi Vektör Geliştirme ve Üretim Direktörü, ve John Whang ederim. Bu çalışma Nörolojik Bozukluklar ve İnme Ulusal Enstitüsü ödenekle R01 NS050408 (JS için) desteklenmiştir.
Material Name | Company | Catalogue Number | |
Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microgrinder | Narishige | EG-44 |