El eficiente síntesis en fase sólida de péptidos de un funcionalizado bis-péptido trímero utilizando un "cierre de seguridad" procedimiento de escisión de la resina HMBA se describe.
En 1962, RB Merrifield publicado el primer procedimiento utilizando síntesis en fase sólida de péptidos como una nueva ruta para sintetizar péptidos eficientemente. Esta técnica demostró rápidamente una ventaja respecto a su antecesor en fase de solución en el tiempo y la mano de obra. Las mejoras sobre la naturaleza del soporte sólido, los grupos protectores empleados y los métodos de acoplamiento utilizados en los últimos cinco años sólo han aumentado la utilidad de sistema original de Merrifield. Hoy en día, el uso de una protección Boc-basado y la base / nucleófilo estrategia de resina de escindible o Fmoc basada en la protección y la estrategia de resina ácida escindible, por primera vez por RC Sheppard, son los más utilizados para la síntesis de péptidos 1.
Inspirados en sólida de Merrifield estrategia apoyado, hemos desarrollado un Boc / terc-butilo en fase sólida estrategia de síntesis para el montaje de funcionalizados bis-péptidos 2, que se describe en este documento. El uso de síntesis en fase sólida en comparación to en fase de solución metodología no es sólo ventajoso en tanto tiempo y trabajo como se describe por Merrifield 1, sino que también permite una mayor facilidad en la síntesis de bis-péptido bibliotecas. La síntesis que se demuestra aquí incorpora una etapa de escisión final que utiliza una de dos pasos "cierre de seguridad" mecanismo para liberar el funcionalizado bis-péptido de la resina por la formación de dicetopiperazina.
Bis-péptidos son rígidos, espiro-escalera oligómeros de bis-aminoácidos que son capaces de posicionar la funcionalidad de una manera predecible y diseñable, controlada por el tipo y la estereoquímica de las unidades monoméricas y la conectividad entre cada monómero. Cada ácido bis-amino es un estereoquímicamente puros, cíclico andamio que contiene dos aminoácidos (un ácido carboxílico con una α-amina) 3,4. Nuestro laboratorio está investigando el potencial de los péptidos funcionales bis-a través de una amplia variedad de campos incluyendo la catálisis, interacciones proteína-proteína y nanomaterials.
El enfoque sintético presenta en este documento proporciona un método para la síntesis de péptidos funcionalizados bis-bis-a partir de unidades de aminoácidos utilizando comunes en fase sólida técnicas de síntesis de péptidos. La síntesis de monómeros de estos bloques de construcción "Pro4" de trans-4-hidroxiprolina 3 es altamente escalable y se ha completado con éxito a la etapa de hidantoína en un 600 mmol (234 g) de escala (no publicado). Una vez que los monómeros están en la mano, el uso de técnicas en fase sólida proporciona un método más rápido de bis-péptido de síntesis que nuestro actual en fase de solución metodología 4, eliminando la necesidad de reacción de trabajo en marcha y purificaciones intermedias.
El principal desafío en la síntesis en fase sólida es el diagnóstico de los avances sintético y la resolución de problemas ya que no hay intermediarios están aislados. Esto ha llevado al desarrollo de muchos ensayos colorimétricos incluyendo aquellos para identificar si aminas libres (Kaiser Prueba 10) o Hydrox libreHMJM (metil rojo de prueba 7) se exponen en la resina. Desafortunadamente, el uso común de prueba Kaiser 10 no es aplicable en general en nuestra síntesis en fase sólida, debido al uso casi exclusivo de aminas secundarias o aminas unidas a un carbono cuaternario. Otras opciones para la evaluación en resina HMBA incluyen divisiones de prueba usando un nucleófilo tal como hidrazina 11, escisión cuantitativa Fmoc seguimiento por UV / Vis 1,11, y la captura y el análisis de entrantes compuestos activados.
Otra cuestión vecinos en síntesis en fase sólida es la naturaleza repetitiva de etapas sintéticas requeridos por el operador. Con esto en mente, los autores recomiendan el uso de una hoja de cálculo o lista de control al realizar cualquier manual de síntesis en fase sólida de péptidos.
La dificultad en el uso de bis-péptidos para síntesis en fase sólida en comparación con comunes α-aminoácidos incluye la posibilidad de acoplamientos más difícil debido a estérico HinDrance, la necesidad de cierres de dicetopiperazina en resina, y desprotecciones simultáneas (Boc / tBu; Cbz / tBu). Otra dificultad radica en conseguir la liberación cuantitativa de la resina usando este "cierre de seguridad" método en comparación con medios más convencionales. Con estos factores en mente, es muy posible que una mayor optimización de este método se puede lograr y los esfuerzos actuales están llevando a cabo en nuestro grupo para mejorar el método que aquí se presenta.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer al Dr. Zachary Z. Brown y Jennifer Alleva para el desarrollo inicial de esta técnica de síntesis en fase sólida y Matthew Parker FL útil para los debates. Este trabajo es apoyado por la Agencia de Defensa de Reducción de Amenazas (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) y el Premio Horst Witzel Beca financiada por Cephalon, Inc.
Name | Company | Catalogue Number | Yorumlar |
HMBA-Am Resin | NovaBiochem | 855018 | |
MSNT | NovaBiochem | 851011 | |
NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
Anhydrous DCM | Acros | 34846 | Carcinogenic |
33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
Anhydrous DMF | Acros | 34843 | Flammable, Toxic |
HOAt | GenScript | C01568 | |
DIC | Acros | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
TIPS | Acros | 21492 | Flammable, Toxic |
Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
NMP | Acros | 36438 | Toxic |
DMAP | NovaBiochem | 851055 | Toxic |
Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher | D1281 | |
SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
LCMS | Agilent | 1200 Series | |
Semi-Prep LC | Hewlett Packard | 1100 Series | |
Lyophilizer | Labconco | 7934027 | |
Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
Argon | Airgas | AR PP300CT |