Diffuse fluorescentie tomografie biedt een relatief goedkope en potentieel hoge hele benadering van de preklinische<em> In vivo</em> Tumor beeldvorming. De methodiek van optische data verzamelen, kalibratie en beeldreconstructie wordt gepresenteerd voor een computertomografie-geleide non-contact tijd-domein systeem met behulp van fluorescerende doelgerichtheid van de tumor biomarker epidermale groeifactor receptor in een muis glioom model.
Kleine dieren fluorescentie moleculaire beeldvorming (FMI) is een krachtige tool voor geneesmiddelen in preklinische ontwikkeling ontdekking en ontwikkeling van studies 1. Echter, de absorptie van licht door weefsel chromoforen (bv hemoglobine, water, lipiden, melanine) beperkt meestal optisch signaal voortplanting door middel van diktes groter dan enkele millimeters 2. In vergelijking met andere zichtbare golflengten, weefsel absorptie voor rood en nabij-infrarood (bijna-IR) absorptie van licht drastisch afneemt en niet-elastische verstrooiing wordt de dominante licht-weefsel interactie mechanisme. De relatief recente ontwikkeling van fluorescerende stoffen die absorberen en licht uitstralen in het nabij-infrarood bereik (600-1000 nm), heeft gedreven de ontwikkeling van beeldvormende systemen en de licht inval modellen die het hele lichaam driedimensionale beeldvorming kan bereiken in kleine dieren 3.
Ondanks de grote vooruitgang geboekt op dit gebied, de slecht-gestelde aard van diffuse fluorescentie tomografie blijft een belangrijkeprobleem voor de stabiliteit, het contrast herstel en de ruimtelijke resolutie van beeldreconstructie technieken en de optimale benadering van FMI in kleine dieren moet nog worden afgesproken. De meerderheid van de onderzoeksgroepen hebben geïnvesteerd in charge-coupled device (CCD)-gebaseerde systemen die overvloedig weefsel-sampling, maar suboptimale gevoeligheid voor 4-9 zorgen, terwijl onze groep en een paar anderen 10-13 hebben uitgeoefend op basis van een zeer hoge gevoeligheid detectoren , waarmee op dat moment dichte weefselmonster alleen worden bereikt ten koste van de lage imaging doorvoer. Hier laten we zien de methodologie voor de toepassing van single-photon detectie technologie in een fluorescentie tomografie systeem te lokaliseren een kankergezwel hersenletsel in een muismodel.
De fluorescentie tomografie (FT)-systeem in dienst enkel foton te tellen met behulp van fotomultiplicatorbuizen (PMT) en informatie-rijke tijd-domein licht detectie in een non-contact exterieur 11. Dit levert een gelijktijdige collectie van de verstrekte excitatie en emissie licht, en omvat automatische fluorescentie excitatie belichtingsregeling 14, laser-referencing, en co-registratie met een klein dier computertomografie (microCT) systeem 15. Een naakt muismodel gebruikt voor beeldvorming. Het dier werd orthotopically geënt met een menselijke glioma cellijn (U251) in de linker hersenhelft en 2 weken later afgebeeld. De tumor werd fluoresceren door injectie van een fluorescerende tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) gericht op epidermale groeifactor receptor, een membraan eiwit bekende overexpressie gebracht in de tumor U251 lijn en andere tumoren 18. Een tweede, ongerichte fluorescerende tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) werd ook geïnjecteerd om rekening te houden voor niet-receptor gemedieerde effecten op de opname van de gerichte tracers om een middel van het kwantificeren van tracer binding en receptor beschikbaarheid / dichtheid bieden 27. Een CT-geleide, time-domein algoritme werd gebruikt om de positie van beide fluorescerende verklikstoffen (de plaats van de tumor) in muizenhersenen en hun vermogen om lokaliseren tumor werd geverifieerd door contrastversterking MRI reconstrueren.
Hoewel gebleken voor fluorescentie beeldvorming in een glioom muismodel, kan de methode in dit video worden uitgebreid tot andere tumormodellen verschillende kleine diermodellen mogelijk tot de grootte van een rat 17.
Fluorescentie tomografie (FT) is een gevoelig, ioniserende straling vrij moleculaire beeldvormende modaliteit op basis van zichtbare en nabij-infrarood licht transport door biologisch weefsel. De meeste van het belang in FT is gericht op de mogelijkheden van drug discovery en ontwikkeling te versnellen in kleine dieren experimentele modellen 1 en een belangrijk terrein van onderzoek is de studie van kanker biomarker expressie en de reactie op moleculaire therapieën 26. Op dit moment zijn er twee concurrerende benaderingen van FT systeemontwerp. De meest voorkomende ontwerp is gebaseerd op gekoelde ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera's fluorescentiedetectie 4-9. Dit ontwerp geeft een hoge dichtheid van metingen maximaliseren weefselmonster aangezien elke pixel in de CCD camera kan licht dat een uniek pad is afgelegd door het weefsel. Echter, CCD-camera's hebben een beperkt dynamisch bereik en lees-out grenswaarden voor het geluid hun ultieme gevoeligheid. Het tweede ontwerp voorkomt mogelijke beperkingen gen van de CCD-camera detectie door het gebruik van zeer gevoelige single-photon tellen van technologie, gebaseerd op het gebruik van dergelijke detectoren fotomultiplicatorbuizen of lawine fotodiodes 10-13. Het nadeel van deze gevoeliger detectiemethoden dat elke detector alleen licht te verzamelen op een punt, dus bereiken dicht weefsel monsters, hetzij veel detectoren te gebruiken (die zeer duur), of meerdere uitsteeksels worden afgebeeld met dezelfde detector (welke kan tijdrovend zijn). Terwijl het optimale niveau van weefsel bemonstering voor kleine dieren FT niet is overeengekomen, en kan variëren van geval tot geval, wordt overeengekomen dat single-photon tellen van instrumenten beter geschikt is om de gevoeligheid grenzen van de FT te verkennen op het gebied haar vermogen om lage concentraties van moleculaire merkers te detecteren. In deze studie geven we een methodologie voor het uitvoeren van FT het gebruik van single-photon tellen detectie apparatuur te lokaliseren tumoren in muizen.
ENT "> Er zijn vier belangrijke stappen om robuuste datasets met tijd-gecorreleerde single-photon tellen FT te produceren. De eerste is de toepassing van een geschikte en eenvoudige kalibratie procedure. In de gepresenteerde methodiek, maar de betrokken gevoeligheden van elke detectie kanaal verantwoord door het verzamelen van een nulmeting excitatielicht doorgegeven via een lijn-diffusor de gelijke fracties van het licht aan elke detector 15 richt. Bovendien wordt het gedetecteerde licht in een experiment continu afgestemd op de laser verwijzing zowel intensiteit en de gemiddelde .-time, wat kan fluctueren in de tijd, door de werking van een laser referentiekanaal 11,15 De tweede belangrijke stap is de juiste inning en co-registratie van anatomische beeldvorming voor begeleide fluorescentie reconstructies De FT gegevens alleen geen anatomische informatie biedt.; Derhalve, om een model van licht transport maken die gebruikt kan worden om de lo reconstruerentoepassing van fluorescerende bronnen in een exemplaar uit de gedetecteerde fluorescentie aan het oppervlak van het monster moeten de anatomie van het monster ten opzichte van het FT systeem nauwkeurig bekend. In ons systeem wordt de anatomische informatie verkregen door een micro-CT-systeem met ruimtelijke coördinaten die ruimtelijk zijn geregistreerd met die van de FT-systeem 15,20. De derde belangrijke stap is ervoor te zorgen dat een optimale belichting (dat wil zeggen, de totale foton detectie tijd voor elke laser projectie) is werkzaam bij elke bron-detector positie. Dit is om twee redenen: zodat er voldoende signaal-ruisverhouding bij elke detectiepositie en tweede detector om verzadiging, waardoor schade de detectie-eenheden te voorkomen. Met het oog op een optimale belichting bij elke detector positie te bereiken, een automatische belichting wordt toegepast, die in wezen triangulates de optimale belichting van twee, laag-signaal blootstelling 14. De vierde kritischestap van de methodologie is dat verwijst naar de verzamelde fluorescentie data om de hoeveelheid uitgezonden excitatie licht. Deze verwijzing wordt ook wel de Born-verhouding, en biedt vele voordelen voor FT, met de voornaamste is een beperking van het model-data mismatch fouten 23,24. De gepresenteerde systeem is ontworpen om zowel fluorescentie en doorvallend excitatielicht gelijktijdig detecteren door channeling het licht in elke detectie kanaal in 2 aparte fotomultiplicatorbuizen. Door dit te doen, vermijden we eventuele effecten van beweging op de juistheid van de Born ratio.Met een robuuste dataset met de hand, beeldreconstructie van tijd-domein van gegevens betreft het oplossen van het inverse probleem van de eindige elementen mesh met de uitdrukking:
d = Jx
waarbij d is een vector met n x m-elementen voor n bron-detector projecties en m TPSF tijd poorten, J is een n x m-voor-l gevoeligheid matrix (of Jacobian) voor l knooppunten in het gaas en x de vector van fluorescentie optische eigenschappen in elk knooppunt met afmetingen l d gekalibreerde gegevens tijdens het experiment en J gesimuleerd met de eindige elementen oplossing. naar het tijdsdomein diffusie onderlinge aanpassing van de fluorescentie transport 25. De tijd dimensie J ook geconvolueerd met de detector specifieke instrument responsies. X is een voorstelling van de fluorescentie kaart van belang en wordt opgelost met een Levenberg-Marqardt niet-negatieve kleinste kwadraten benadering Tikhonov regularisatie 15.
De methodiek die hier, die beschrijft een procedure die kan lokaliseren van fluorescent gelabelde tumoren in muizen met behulp van zeer gevoelige foton tellen fluorescentiedetectie, heeft de potentie om de grenzen van de FT te duwen. In een eerdere studie, het potentieel van de tewerkstelling van dezebenadering groter dan muizen diermodellen, zoals ratten, alsmede verbeterde gevoeligheid ten opzichte van bestaande installatie ontwerpen muis grote specimens werd aangetoond 17. De onmiddellijke toepassing van deze aanpak zou zijn voor de monitoring van biomarker expressie in vivo in kleine dieren tumor modellen om de werkzaamheid van drugs beoordelen in een high-throughput middelen. Het vermogen van het systeem op te wekken en fluorescentie detecteren op meerdere golflengtes kan de gelijktijdige detectie van meerdere fluorescerende markers. Extra fluorescerende merkers een middel van het ondervragen meerdere aspecten van een pathologie, tegelijkertijd, of kan worden gebruikt, zoals in deze studie, om meer kwantitatieve beeldvorming benaderingen, zoals dual-reporter-methoden voor het meten in vivo binding potentieel, een marker van receptor dichtheid in dienst 26,27.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de National Cancer Institute van de subsidies R01 CA120368, R01 CA109558 (KMT, RWH, FEG, BWP), RO1 CA132750 (MJ, BWP) en K25 CA138578 (FL), en de Canadese Institutes of Health Research postdoctoraal fellowship award (KMT ). De ontwikkeling van de fluorescentie tomografie systeem werd gedeeltelijk gefinancierd door Advanced Research Technologies (Montreal, QC).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
IRDye 800CW-EGF | LI-COR Biosciences | 926-08446 | |
Alexa Fluor 647, succinimidyl ester | Life Technologies | A20106 | Reacted with water to minimize non-specific binding |