Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso
Özet
Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l'uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi subpopulationswithin<em> B. subtilis</em> Biofilm mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.
Abstract
Formazione di biofilm è un attributo per quasi tutti i batteri 1-6. Quando batteri formano biofilm, le cellule sono racchiusi nella matrice extracellulare che è prevalentemente costituito da proteine e esopolisaccaridi, tra gli altri fattori 7-10. La comunità microbica racchiuso all'interno del biofilm spesso mostra la differenziazione della distinta sottopopolazione di cellule specializzate 11-17. Queste sottopopolazioni coesistono e spesso mostrano organizzazione spaziale e temporale all'interno del biofilm 18-21.
Formazione di biofilm nel modello Bacillus subtilis richiede la differenziazione delle sottopopolazioni di cellule specializzate distinte. Tra questi, la sottopopolazione di produttori matrice, responsabili di produrre e secernere la matrice extracellulare del biofilm è essenziale per la formazione di biofilm 11,19. Pertanto, la differenziazione dei produttori matrice è una caratteristica della formazione di biofilm in B. subtilis.
Abbiamo usato giornalisti fluorescenti per visualizzare e quantificare la sottopopolazione di produttori matrice in biofilm di B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, abbiamo osservato che la sottopopolazione di produttori matrice differenzia in risposta alla presenza di autoprodotto segnale extracellulare surfattina 25. È interessante notare, surfattina è prodotto da una sottopopolazione di cellule specializzate diverse dalla sottopopolazione di produttori matrice 15.
Abbiamo riportato in questa relazione l'approccio tecnico necessario per visualizzare e quantificare la sottopopolazione dei produttori e dei produttori matrice surfattina nei biofilm di B. subtilis. Per fare questo, reporter fluorescenti di geni necessari per la produzione di matrice e di produzione di surfattina sono inseriti nel cromosoma di B. subtilis. Reporter sono espressi solo in una sottopopolazione di cellule specializzate. Quindi, le sottopopolazioni possono esseremonitorata utilizzando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso (Fig. 1).
Il fatto che diverse sottopopolazioni di cellule specializzate coesistono all'interno delle comunità multicellulari di batteri ci dà una prospettiva diversa sulla regolazione dell'espressione genica nei procarioti. Questo protocollo affronta questo fenomeno sperimentalmente e può essere facilmente adattato a qualsiasi modello di altre lavorazioni, per chiarire i meccanismi molecolari alla base eterogeneità fenotipica all'interno di una comunità microbica.
Protocol
Discussion
Il fatto che le comunità batteriche mostrano sottopopolazioni di cellule che esprimono set specifico di geni evidenzia la complessità delle comunità microbiche 33,34. Questo protocollo dovrebbe aiutare a determinare se l'espressione di un gene di interesse viene limitata a un particolare sottopopolazione di cellule specializzate nella comunità microbica. Visualizzazione di tali sottopopolazioni richiede lo sviluppo di nuove tecniche, perché i metodi tradizionali per monitorare l'espressione genic…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è finanziato dal programma Young Investigator Research, dal Centro di ricerca sulle malattie infettive (ZINF) presso l'Università di Würzburg. Juan Garcia-C Betancur è un collega dottorato di ricerca presso la Graduate School of Life Sciences (GSLS) dell'Università di Würzburg.
Materials
| Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
| MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
| Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
| Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
| Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
| Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
| Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
| Name of the equipment | Company | Catalog number | |
| Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
| Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
| Name of the software | Company | Catalog Number | |
| Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
| Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
| Flow cytometry | FlowJo | Treestar |
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