의 단일 세포 분석 바실러스 subtilis Biofilms
Özet
미생물 biofilms은 일반적으로 전문의 세포 독특한 subpopulations에 의해 형성된다. 이러한 subpopulations의 단일 세포 분석은 형광 기자의 사용을 필요로합니다. 여기 몇 가지 subpopulationswithin을 시각화하고 모니터하는 프로토콜을 설명<em> B. subtilis</em> 형광 현미경 및 유동세포계측법을 사용 biofilms.
Abstract
Biofilm 형성은 거의 모든 박테리아 1-6에 일반 속성입니다. 박테리아가 biofilms를 형성하면, 전지는 주로 7-10 기타 요인 중에서 단백질과 exopolysaccharides에 의해 형성되는 세포외 기질에 쌌다 있습니다. 미생물 커뮤니티는 종종 11-17 특화된 세포의 뚜렷한 subpopulation의 분화를 보여줍니다 biofilm 내에서 이탈식. 이러한 subpopulations가 공존하며 종종 biofilm 18-21 사이 공간과 시간적 조직을 보여줍니다.
모델 유기체 바실러스 subtilis의 Biofilm 형성은 전문적인 세포의 뚜렷한 subpopulations의 분화가 필요합니다. 그중 biofilm의 세포외 기질을 생산하고 분비하는 책임 매트릭스 제작자의 subpopulation는 biofilm 형성 11,19 위해 필수적입니다. 따라서 매트릭스 생산자의 차별화는 B에 biofilm 형성에 각인되어있는 것입니다 subtilis.
우리는 B.의 biofilms에서 매트릭스 생산 subpopulation을 시각화하고 수치 형광 기자를 사용한 subtilis 15,19,22-24. 구체적으로, 우리는 매트릭스 생산 subpopulation 자기 생산 세포 신호 surfactin 25 존재에 대한 응답으로 차별화 것을 관찰했습니다. 흥미롭게도 surfactin는 매트릭스 생산자 15 subpopulation과 다른 특수 세포 subpopulation에 의해 생산됩니다.
우리는이 보고서 바실러스 subtilis의 biofilms 이내 매트릭스 생산자와 surfactin 생산자의 subpopulation을 시각화하고 계량하는 데 필요한 기술적인 접근 방식에 자세히 있습니다. 이렇게하려면 행렬 생산 및 surfactin 생산에 필요한 유전자의 형광 기자 B.의 염색체에 삽입됩니다 subtilis. 기자는 전문화된 세포 subpopulation에 표현됩니다. 다음 subpopulations가 될 수 있습니다형광 현미경 및 유동세포계측법합니다 (그림 1 참조)을 사용하여 모니터.
전문 세포의 다른 subpopulations는 박테리아의 다세포 지역 사회 내에 공존한다는 사실은 우리에게 prokaryotes의 유전자 발현의 조절에 대해 다른 관점을 제공합니다. 이 프로토콜은 실험적으로 이러한 현상을 해결하고 쉽게 미생물 지역 사회 내에서 phenotypic 이질의 기본 분자 메커니즘을 명료하게하다하기 위해 다른 작업 모델에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
세균성 커뮤니티 유전자 증거 미생물 커뮤니티 33,34의 복잡의 특정 집합을 표현하는 세포의 subpopulations 보여주는 사실. 이 프로토콜은 관심사의 유전자의 표현이 미생물 지역 사회 내에서 전문화된 세포의 특정 subpopulation로 제한 여부를 확인하는 데 도움이됩니다. 전통적인 방법은 전체 미생물 커뮤니티 및 미생물 지역 사회 내에서 유전자 발현의 변동에 대한 유전자 발현이나 microarray 분…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 뷔르츠부르크 대학에서 감염증 연구 센터 (ZINF)에서 젊은 탐정 연구 프로그램으로 후원됩니다. 후안 C 가르시아-Betancur은 뷔르츠부르크 대학의 생명 과학 대학원 (GSLS)에서 박사 동료입니다.
Materials
| Technique | Name of the reagent | Company | Catalog number |
| MSgg composition | potassium phosphate 5mM | Roth | 6878 |
| MOPS 100mM | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Magnesium chloride 2mM | Roth | 2189.1 | |
| Calcium chloride 700μM | Roth | A119.1 | |
| Ferric chloride 50μM | Sigma-Aldrich | 157740 | |
| Zinc chloride 1μM | Applichem | A2076 | |
| Thiamine 2μM | Sigma-Aldrich | 74625 | |
| Glycerol 0.5% | Roth | 7533 | |
| Glutamate 0.5% | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| Tryptophan 50μg/ml | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Phenylalanine 50μg/ml | Sigma-Aldrich | P2126 | |
| Cell fixation | Paraformaldehyde | Roth | 0335 |
| Name of the equipment | Company | Catalog number | |
| Sonication | Cell Sonicator | Bandelin | D-1000 |
| Fluorescence Microscopy | Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000B |
| Name of the software | Company | Catalog Number | |
| Fluorescence Microscopy | AsaF | Leica | |
| Flow cytometry | FCASDiva | BD | |
| Flow cytometry | FlowJo | Treestar |
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