Populations cellulaires Caractérisation électrophysiologique des exprimant la GFP dans la rétine intacte

La description suivante suppose que l'expérimentateur a une compréhension de base de la structure de la rétine, patch-clamp, et microscopie à deux photons. Pour plus d'informations utiles sur l'établissement et l'exécution d'un setup de patch-clamp et le système d'imagerie à deux photons voir les références [7-12]. 1. Des animaux et de préparation des tissus Gardez la souris adaptés à l'obscurité pendant au moins 3 h. En attendant, préparez 1-2 L de solution extracellulaire constituée d'(en mm) 125 NaCl, KCl 2,5, CaCl 2 1, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glucose et s'équilibrer à pH 7,4 par gazage au carbogène (5% de CO 2 en O 2) à température ambiante. d'un Euthanasier la souris dans une chambre étanche à l'air par le CO 2 surdose suivie par dislocation cervicale. Cette procédure et les étapes suivantes doivent être effectuées dans l'obscurité. Utilisez dim longueur d'onde d'illumination (nous bloquons courtes longueurs d'onde d'une source de lumière froide par un 690 nm-longpass filtre) pour appuyer la vision personnelle tout en gardant les yeux de l'animal adaptés à l'obscurité (les souris ont une mauvaise vue que dans la partie rouge du spectre lumineux). Pour travailler dans l'obscurité d'illumination utilisation complète infrarouge (> 800 nm) et l'usure lunettes de vision nocturne. Énucléer les yeux avec une paire de ciseaux à iris courbes et les transférer à un plat de solution extracellulaire placé sous un microscope à dissection. Retirez la cornée et le corps ciliaire par l'ouverture de l'ampoule oeil le long de la ora serrata (la frontière entre la rétine et du corps ciliaire) avec une paire de ciseaux à ressort (nous utilisons d'abord une lancette pour percer un point de départ pour la coupe). Sortez de la lentille et de séparer soigneusement la rétine de l'épithélium pigmentaire. Si l'orientation de la rétine est crucial pour votre étude, indiquent comme ça, en référence [12]. Couper le nerf optique entre la rétine et l'épithélium pigmentaire de la rétine et de supprimer de l'œilleton. Notez la direction de la surface rétinienne: l'intérieur de la rétine lovée est le Ganglcôté pile ion; l'extérieur est le côté photorécepteur. Enlever le vitré de la surface intérieure de la rétine par le tirant doucement hors à l'aide d'un cure-dent en bois. Pour ce faire, utilisez un petit volume de solution extracellulaire qui couvre juste la rétine. Les bâtons vitreux à le cure-dents et peut être traîné par centrifugation sur la rétine. Puis, appliquez courtes incisions le long du périmètre pour faciliter la rétine aplatissement du tissu. Transfert de la rétine dans la chambre d'enregistrement des photorécepteurs vers le bas, l'étaler sur le fond de verre (nous utilisons un pinceau fin) et l'immobiliser avec un châssis de nylon tendus en acier inoxydable. Préparer la rétine seconde de la même manière et le garder adaptés à l'obscurité dans la solution extracellulaire carboxygenated pour une utilisation ultérieure. 2. Enregistrements Installez la chambre d'enregistrement dans les ténèbres sous un microscope laser verticale de numérisation et de la préparation superfuse rétine en permanence (pas moins de 5 ml / min) avec la solution extracellulaire carboxygenated chauffée à 35 ° C. Le microscope (également équipé d'une caméra infrarouge sensible CCD) est situé sur un amortisseur de table de l'air intérieur d'une cage de Faraday pour la protection électronique. Couvrir la cage avec un rideau opaque pour maintenir la préparation dans l'obscurité. Nous avons également l'écran de la lumière à partir des écrans d'ordinateur par un film transparent rouge. Réglez le laser infrarouge pour 850-870 nm ou plus des longueurs d'onde, de passer en mode verrouillage de l'état et l'utilisation excitation à deux photons pour visualiser exprimant la GFP cellules. Atténuer la sortie du laser à l'aide de filtres de densité neutre contrôlé par le logiciel de numérisation laser, jusqu'à un degré qui est juste suffisante pour une reconnaissance claire de la cellule fluorescente Pour les enregistrements de patch-clamp dans le mode actuel micropipettes-clamp en verre (nous utilisons des tubes en verre borosilicate de 1,5 mm de diamètre extérieur et 0,225 mm d'épaisseur) rempli avec une solution composée de intracellulaires (en mm) 125 K-gluconate, 10 KCl, 0,5 EGTA 10, HEPES, titrée à pH 7,4 avec KOH (donnant une résistance pipette d'environ 5 MW). Notez que d'autres conditions expérimentales comme la tension-clamp nécessite une solution différente. Si les injections de colorant sont désiré, ajouter une sonde fluorescente (nous utilisons 10 mM Alexa Fluor 594) ou une molécule traceur (3% Neurobiotin). Insérez la micropipette dans le support et s'assurer que l'électrode de référence (fil d'argent chlorés) est en contact avec la solution extracellulaire dans la chambre d'enregistrement. Appliquer une pression à la micropipette et de cibler une cellule exprimant la GFP (nous utilisons un objectif de 40 fois l'eau d'immersion; NA 1,25). Corps cellulaires amacrines sont situés dans la couche des cellules ganglionnaires (directement sous la surface dans l'orientation actuelle de la rétine) ainsi que dans la partie proximale de la couche nucléaire interne (environ 55 à 75 um profondément dans la préparation). Avant le contact avec la cellule micropipette ciblées, la membrane limitante interne (une gaine faite de cellules gliales endfeet) à la rétinesurface doit être pénétré. Pénétration réussie est reconnue par la solution intracellulaire qui est chassé de la pointe de micropipette et se détache de la membrane limitante interne de la rétine tissus sous-jacents que l'on peut observer sur une image infrarouge en transmission capturée par la caméra IR-CCD. Approche de la cellule souhaitée en comparant la position soma de l'image à deux photons avec l'image de la caméra IR-CCD montrant la position de la micropipette enregistrement. Notez que cette étape n'est pas facile à réaliser et nécessite une certaine pratique, car la cellule exprimant la GFP doit être reconnu à l'image de transmission infrarouge afin de diriger la micropipette vers elle. Ciblage correct est atteint lorsque la pointe micropipette causes de capitons de la surface cellulaire qui peut être vu dans l'image à deux photons. Alternative à cette procédure, utilisez un colorant fluorescent (par exemple, Alexa Fluor 594, 100 pM) dans la solution intracellulaire de révéler la position micropipette dans l'image à deux photons. Excitation à deux photons infrarouges permet de fluorescence suffisante de ce colorant pour rendre la micropipette perceptible. Pour ce faire, réglez la plage de détection du logiciel de numérisation laser pour couvrir également la fluorescence rouge. Communiqué de la pression de la micropipette et obtenir une cellule entière de patch-clamp de configuration dans le courant-clamp mode. Un enregistrement exploitable devrait donner un potentiel de membrane de -50 à -55 mV et durer au moins 20 min. Présent stimuli visuels créés par un logiciel de stimulation (nous utilisons QDS par Thomas d'Euler, Université de Tübingen, Allemagne) 11 sur un écran d'ordinateur. Ajustez la position spatiale de la stimulation à être centré sur la cellule enregistrés: Marquer la position de la cellule sur le moniteur montrant l'image de transmission de la caméra IR-CCD et un centre de stimulation place, comme sur celle-ci. Tune l'intensité du stimulus en insérant filtres de densité neutre dans le trajet du faisceau. Pour l'étalonnage du spectre de surveiller et de l'intensité voir réf [14]. Choisir un Prolonged interstimulus intervalle (par exemple 15 s) afin d'éviter d'adaptation. Inclure une photodiode dans le trajet du faisceau de garder une trace du timing de relance. Démarrez le protocole de stimulation et d'enregistrer les réponses de lumière (nous utilisons un taux d'échantillonnage de 10 kHz avec un filtrage à 5 kHz pour les non-dopage cellules; pour l'enregistrement de pic un taux plus élevé d'échantillonnage de 20 kHz, comme il est recommandé). Utilisez le logiciel stimulation lumineuse pour déclencher le logiciel d'enregistrement. Pour le remplissage de colorant laisser le diffuse agent fluorescent dans la cellule enregistrée pendant 30-45 min avant attentivement rétractant la micropipette de la cellule. Prenez soin de ne pas sortir le corps de la cellule. Si le non-fluorescent traceur Neurobiotin a été utilisé, il doit la visualisation en se liant à la streptavidine conjuguée à un fluorophore (nous utilisons la streptavidine-Cy3, 1:400 pendant la nuit à 4 ° C après 20 min de fixation paraformaldéhyde de la rétine; pour le colorant de couplage Des études streptavidine incubation peut être prolongée à 3 d). Alternativement, les injections peuvent aussi être réalisées avecélectrodes forte (> 100 MQ) lorsque le colorant est entraîné par iontophorèse dans la cellule empalé (impulsions rectangulaires: de 0,25 à 1 nA, 100 ms, l'intervalle de 100 ms, temps total 3-6 min). 3. Les résultats représentatifs: Les résultats suivants proviennent d'une étude sur les souris exprimant une protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur de la tyrosine hydroxylase 13,14, l'enzyme catalysant l'étape limitante dans la synthèse des catécholamines (TH:: GFP souris). Basé sur la luminosité des deux signaux GFP-populations de cellules distinctes se distinguent (figure 2A). Les cellules exprimant le niveau supérieur GFP possèdent des corps cellulaires situés dans la couche nucléaire interne (INL, figure 2A) ou déplacées dans la couche des cellules ganglionnaires (GCL, figure 2B) et stratifier au milieu de la couche interne plexiforme (IPL, figure 2C) . Ils ont été identifiés comme des cellules de type 2 14-16 et pourraient être systématiquement étudiés par rapport à la morphologie (figure 3) et élireriques d'activité (figure 4), même si sa densité de population ne s'élève qu'à 250 cellules / mm 2. Figure 1. Représentation schématique du dispositif expérimental. Excitation à deux photons (rouge trajet de la lumière en pointillés) du fluorophore cellules exprimant dans la rétine intacte permet visuelle ciblage par une micropipette (chemin vert émission de lumière). La rétine est soumis à des stimuli optiques projetée à travers le condenseur du microscope (trajet de la lumière jaune), et les réponses cellulaires légers sont enregistrés. Figure 2. GFP cellules exprimant dans un flatmount rétinienne d'un TH:: la souris GFP. Deux populations peuvent être distinguées par l'éclat de la GFP-signal: le type 1 (cellules DA), situé à l'INL montrant une faible fluorescence (A, voir flèches) et le type intensément marquées 2 cellulesavec les corps cellulaires, soit dans l'INL (A, voir flèches) ou déplacées dans la GCL (B) et une stratification dendritiques dans la strate S3 de l'IPL (C). Barres d'échelle, 50 um. Figure 3. Morphologie d'un type 2 de cellules injectées avec le Neurobiotin traceur. Le traceur est ensuite visualisé par streptavidine-Cy3 contraignant (magenta). La micrographie, qui est également représentant le signal GFP (green), est une projection de piles d'images couvrant la GCL et l'IPL. La barre d'échelle, 50 um. Figure 4. Lumière des réponses d'une cellule de type 2 situé dans le GCL. Modèle de réponse à la lumière blanche plein champ d'illumination d'intensité croissante dans la gamme scotopique. L'intensité du stimulus est donné dans photoisomerizations par canne par seconde (Rh * / tige / s). Un stimulus prolongé de 3 s a été utilisé pour une meilleure distinctesions des éléments de réponse au début du stimulus (sur la réponse) et offset (OFF réponse).