Мы описываем использование perfluorodecalin как инфильтративный монтажа среды. Это простой способ улучшения глубину изображения в<em> Arabidopsis thaliana</em> Ткани листа с минимальным физиологическим воздействием.
Проблема получения изображений с высоким разрешением вглубь биологических образцов широко признается 1. В заполненных воздухом ткани, такие как губчатые мезофилла листьев растений или позвоночных легкие дополнительные трудности возникают из нескольких переходов в преломления между клеточными компонентами, между клетками и воздушного пространства, а также между биологической ткани и остальной частью оптической системы. Более того, показатель несоответствия индекса приводит к затуханию флуорофора возбуждения и эмиссии сигнала в флуоресцентной микроскопии. Мы описываем здесь применение перфторуглеродов, perfluorodecalin (ПФО), как инфильтративный среду визуализации который оптически улучшает лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) образец изображения на глубине, не прибегая к повреждающим увеличения мощности лазера и оказывает минимальное физиологическое воздействие 2. Мы опишем протокол для использования в ПФО с Arabidopsis thaliana ткани листа, который является оптически сложным, как в результате егоструктуры (рис. 1). ПФО имеет ряд атрибутов, которые делают его подходящим для этих целей 3. Преломления ПФО (1,313), сопоставима с показателями воды (1,333) и ближе к цитозоле (около 1,4), чем воздух (1.000). Кроме того, ПФО легко доступна, не флуоресцентные и не токсичен. Низкое поверхностное натяжение ПФО (19 дин см -1) ниже, чем у воды (72 дин см -1), а также ниже предела (25 – 30 дин см -1) для проникновения устьичного 4, что позволяет ей наводнения губчатого мезофилла воздушного пространства без применения потенциально разрушительные вакууме или поверхностно-активных веществ. Наконец, и самое главное, ПФО имеет большой потенциал для растворения СО 2 и О 2, которая позволяет газообмен будет поддерживаться в затопленном ткани, таким образом минимизируя влияние на физиологические образца. Эти свойства были использованы в различных приложениях, которые включают частичное жидкости дыхания и легких инфляцииТион 5,6, хирургия 7, искусственной крови 8, оксигенации питательной среды 9, и исследования кристаллов льда образование в растениях 10. В настоящее время он является общим для монтирования ткани в воду или водный буфер для живых конфокальной микроскопии. Мы считаем, что использовать ПФО в качестве монтажной среда представляет собой улучшение по существующей практике и позволяет простым подготовки живых образцов цельной лист для работы с изображениями.
Это простой и легкий в использовании техники для улучшения микроскопии заполненных воздухом или оптически комплекс тканей. Мы показали, что метод имеет ряд существенных преимуществ, и мы надеемся, что он будет использоваться, чтобы выяснить биологические вопросы, связанные с воздушным богатых тканей. Например, было бы естественным выбором для исследования патогенных атаке в растительных мезофилла или в легких. Мы также осознаем ограниченность техники. Мы работаем над лучшей преломления соответствующий индекс, используйте с другими видами микроскопии и перфторуглеродов mountant пополнения в течение длительных сроков экспериментов. Мы также признаем, однако, что одним из основных преимуществ ПФУ, то есть быть биологически инертным есть обратная сторона. ПФУ не растворяются биологических молекул, которая также подразумевает, что они не могут быть легко использованы для доставки соединений, представляющих интерес, таких как гормоны, наркотики, и других малых молекул или ионов.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить профессора Николая Смирнова из Университета Эксетера за совет и Университет фонда Bioimaging Эксетер. Финансирование было предоставлено Великобритании биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (грант ссылкой BB/E002682/1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |