Nós descrevemos o uso de perfluorodecalin como um meio de montagem infiltrativa. Este é um método simples para melhorar a profundidade da imagem em<em> Arabidopsis thaliana</em> Tecido foliar com impacto fisiológico mínimo.
O problema de aquisição de imagens de alta resolução em profundidade amostras biológicas é amplamente reconhecido 1. No ar cheio de tecidos como o mesofilo esponjoso de folhas das plantas ou dos pulmões dos vertebrados mais dificuldades surgem de várias transições no índice de refração entre os componentes celulares, entre as células e espaços aéreos e entre o tecido biológico eo resto do sistema óptico. Além disso, desencontros índice de refração levar a atenuação da excitação fluoróforo e emissão de sinal em microscopia de fluorescência. Descrevemos aqui a aplicação do perfluorocarbono, perfluorodecalin (PFD), como um meio de imagens infiltrativa que melhora a ótica de varredura a laser microscopia confocal (LSCM) imagem da amostra em profundidade, sem recorrer a aumentos prejudiciais na potência do laser e tem impacto fisiológico mínimo 2. Nós descrevemos o protocolo para utilização do PFD com tecido de Arabidopsis thaliana folha, que é opticamente complexas, como resultado de suaestrutura (Figura 1). PFD tem uma série de atributos que o tornam adequado para este uso 3. O índice de refração do PFD (1,313) é comparável com a de água (1.333) e é mais próximo ao do citosol (aprox. 1,4) do que o ar (1,000). Além disso, PFD está prontamente disponível, não-fluorescentes e não é tóxico. A baixa tensão superficial da PFD (19 dinas cm -1) é menor que a da água (72 dinas cm -1) e também abaixo do limite (25 – 30 cm dyne -1) para a penetração estomática 4, que permite a inundação o mesofilo esponjoso espaços aéreos sem a aplicação de um vácuo potencialmente destrutiva ou surfactante. Finalmente, e crucialmente, PFD tem uma grande capacidade para dissolver CO 2 e O 2, que permite a troca de gás para ser mantido no tecido inundadas, minimizando assim o impacto fisiológico sobre a amostra. Estas propriedades têm sido usados em várias aplicações que incluem respiração líquida parcial e pulmão inflação 5,6, a cirurgia 7, 8 sangue artificial, a oxigenação de crescimento media 9, e os estudos de formação de cristais de gelo nas plantas 10. Atualmente, é comum para montar o tecido em água ou tampão aquoso para a imagem latente confocal ao vivo. Consideramos que o uso de PFD como um meio de montagem representa uma melhoria em prática existente e permite a preparação simples de viver amostras de folhas inteiras para imagem.
Esta é uma técnica simples e fácil de usar para melhorar a microscopia de ar-cheios ou opticamente complexas tecidos. Nós mostramos que a técnica tem algumas vantagens forte e esperamos que ele será usado para elucidar questões biológicas relacionadas com ar-ricos tecidos. Por exemplo, seria uma escolha natural para estudos de ataque de patógenos no mesofilo de plantas ou nos pulmões. Nós também estamos cientes das limitações da técnica. Estamos trabalhando em uma melhor adequação do índice de refração, use com outros modos de microscopia, perfluorocarbono e reposição de montagem durante longos experimentos prazo. Também reconhecemos, no entanto, que uma das principais vantagens do PFC, ou seja, sendo biologicamente inerte tem um flipside. PFCs não são facilmente dissolver moléculas biológicas que também implica que eles não podem ser facilmente usados para compostos de interesse, tais como hormônios, drogas e outras pequenas moléculas ou íons.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao Prof Nicholas Smirnoff, da Universidade de Exeter para o seu conselho e da Universidade de Exeter Facility BioImaging. O financiamento foi fornecido pelo UK Biotecnologia e Ciências Biológicas Research Council (concessão de referência BB/E002682/1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |