Nous décrivons l'utilisation de perfluorodécaline comme un moyen d'infiltration de montage. C'est une méthode simple pour améliorer la profondeur de l'imagerie dans<em> Arabidopsis thaliana</emTissus de la feuille> avec impact physiologique minime.
Le problème de l'acquisition d'images haute résolution en profondeur dans des échantillons biologiques est largement reconnue 1. Dans l'air rempli de tissus tels que le mésophylle spongieux des feuilles des plantes ou des poumons de vertébrés autres difficultés proviennent de plusieurs transitions de l'indice de réfraction entre les composants cellulaires, entre les cellules et espaces aériens et entre les tissus biologiques et le reste du système optique. Par ailleurs, les inadéquations indice de réfraction conduire à une atténuation de l'excitation et d'émission du signal fluorophore en microscopie à fluorescence. Nous décrivons ici l'application du perfluorocarbone, perfluorodécaline (VFI), comme un moyen d'imagerie infiltrante qui améliore optiquement microscopie confocale à balayage laser (LSCM) de l'échantillon d'imagerie en profondeur, sans recourir à des augmentations d'endommager la puissance du laser et a un impact minimal sur physiologiques 2. Nous décrivons le protocole d'utilisation des VFI avec le tissu des feuilles d'Arabidopsis thaliana, ce qui est optiquement complexes en raison de sesstructure (figure 1). PFD a un certain nombre d'attributs qui le rendent approprié pour cet usage 3. L'indice de réfraction du VFI (1,313) est comparable à celle de l'eau (1,333) et est proche de celui de cytosol (environ 1,4) que l'air (1.000). En outre, les VFI sont facilement accessibles, non fluorescentes et est non toxique. La faible tension de surface du VFI (19 dynes cm -1) est plus faible que celle de l'eau (72 dynes cm -1) et également inférieur à la limite (25 – 30 cm Dyne -1) pour la pénétration stomatique 4, ce qui lui permet d'inonder les espaces aériens mésophylle spongieux sans l'application d'un vide potentiellement destructeurs ou d'un tensioactif. Enfin et surtout, VFI a une grande capacité à dissoudre le CO 2 et O 2, qui permet l'échange de gaz pour être maintenu dans le tissu inondées, minimisant ainsi l'impact physiologique sur l'échantillon. Ces propriétés ont été utilisées dans différentes applications qui incluent la respiration partielle liquides et pulmonaires inflationtion 5,6, la chirurgie 7, 8 du sang artificiel, l'oxygénation de la croissance des médias 9, et les études de la formation de cristaux de glace dans les plantes 10. Actuellement, il est courant de monter des tissus dans l'eau ou tampon aqueux pour l'imagerie confocale en direct. Nous considérons que l'utilisation des VFI comme un milieu de montage représente une amélioration sur la pratique existante et permet la préparation simple de vivre ensemble des échantillons de feuilles pour l'imagerie.
C'est une technique simple et facile à utiliser pour améliorer la microscopie remplis d'air ou optiquement complexes tissus. Nous avons montré que la technique a des avantages solides et nous espérons qu'il sera utilisé pour élucider des questions biologiques se rapportant à l'air riche en tissus. Par exemple, il serait un choix naturel pour les études de l'attaque de pathogènes dans mésophylle des plantes ou dans les poumons. Nous sommes également conscients des limites de la technique. Nous travaillons sur une meilleure adéquation entre l'indice de réfraction, l'utilisation des autres modes de microscopie et de réapprovisionnement perfluorocarbone milieu de montage pendant de longues expériences calendrier. Nous reconnaissons aussi, cependant, que l'un des principaux avantages de PFC, à savoir être biologiquement inertes a une Flipside. PFC ne se dissolvent pas facilement des molécules biologiques qui implique également qu'ils ne peuvent pas être facilement utilisé pour délivrer des composés d'intérêt tels que les hormones, les médicaments et autres petites molécules ou d'ions.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le professeur Nicholas Smirnoff de l'Université d'Exeter, pour ses conseils et de l'Université de l'installation de bio-imagerie Exeter. Le financement a été fourni par la biotechnologie et sciences biologiques au Royaume-Uni Conseil de recherches (subvention de référence BB/E002682/1).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |