Compartmentalizing микрофлюидных устройство для исследования раковых стволовых клеток миграции описано. Этот роман платформы создает жизнеспособную сотовой микросреды и позволяет микроскопическим визуализации живых передвижения клетки. Высокая подвижность раковых клеток выделяют для изучения молекулярных механизмов агрессивного проникновения, что может привести к более эффективному лечению будущем.
In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further.
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.
Микрофлюидных устройства и записи изображений технику, представленные здесь позволяет визуально характеристик клеточной морфологии во время миграции. По сравнению с существующими традиционными методами, микрофлюидных платформа имеет преимущества экономичности, высокой пропускной способности и гибкости конструкции. Представленные микроскопической системы визуализации позволяет изучать и регистрации долгосрочных живой миграции клеток. Объектив собственная функция позволяет отслеживать несколько путей миграции в изображение с высоким разрешением, не нарушая образца.
При сборке устройства, штамп PDMS не является постоянно соединена с покровным стеклом для удобства нанесения покрытия PDL (шаг 3,4). Это имеет решающее значение для достижения хорошего уплотнения для успеха этого протокола. Загрязнение введен с устройством изготовления, таких, как пузырек воздуха в печать или пыли / мусора на подложке, может поставить под угрозу связи и привести к утечке жидкости. Таким образом, treatiнг устройство в пыли образом важно не допустить ошибки устройства. До PDL-покрытия, стекла покровные являются азотная кислота лечение и PDL раствор центрифугируют для удаления пыли / мусора. Мы считаем, скотч, алкоголь полоскания, и вода ванны очень полезны для удаления пыли / мусора с штамп PDMS, если чистый номер не доступен. После штамп PDMS контакте с покровным стеклом, постукивая штамп осторожно с помощью пинцета облегчает печать.
BTSCs может быть обогащен из человеческих образцов операционного зала через сферу культуры в стволовой клеточной среде, похожие на культуре нормальных нервных стволовых клеток 10. BTSCs обогащенные таким образом продемонстрировать стволовых клеток, как свойства, такие как экспрессия маркеров стволовых клеток (CD133, нестин), дифференциация на несколько нейронных линий (глии и нейронов), и опухоль начала в ортотопической иммунодефицитных мышей с моделью всего 100 клетки 18. Хотя некоторые дебаты существует около purifiкатионов и обслуживание 1 BTSCs, 19-21, сфера взрослый BTSCs лучше поддерживать фенотипа и генотипа родительских опухоли 22-24.
Разобщенным пространство имитирует физиологическую среду для миграции клеток. В нашем устройстве, BTSC проявляют значительный потенциал миграции в размере ограниченных пространством путем регулирования клеточной морфологии. Наша характеристика ячейки морфологических изменений указывает режим-преобразования в шести последовательность этап, который может моделировать возможные новые подробное описание BTSC вторжения в соседние мозга. На ранних стадиях, клетки получают значительное количество полярности и генерировать клей выступы эффективно закрепить себя внутри микроканала. Как только клетка размещение в микроканале установлена, она превращается в крейсерском режиме и поддерживает этот режим в течение всего путешествия по микроканала. На данном этапе, BTSC поддерживать высокую подвижность и последовательное направление, но экономить энергию. Вterestingly, кажется, что одна микроканальных ограничивается одной крейсерской ячейки за один раз, так что, когда одна клетка доходы до этой стадии, другие отступления клеток из микроканала. Этот механизм гарантирует, вероятно, эффективность распространения опухоли и предотвращает чрезмерное потребление питательных веществ в микроканала. После завершения миграции через микроканала, клетка восстанавливает свою склонность к разнонаправленной выступов и дальнейшего изучения заражения цели или новые пути миграции. Compartmentalizing микрофлюидных устройство предлагает новый в пробирке означает создание микроокружения для изучения BTSC инфильтрации паренхимы мозга.
Этот метод может быть легко адаптирована к изучению раковых стволовых клеток (ЦОК) и мигрирующих клеточных линиях, полученных от других типов опухолей. Культивирование клеток в микрофлюидных устройство может быть выполнено в любой современной биологической лаборатории, оснащенной инкубатора и опыта культуре ткани. Оснащен SU-8 мастер, PDMSлитье и сборку устройства возможны с некоторой фундаментальной подготовки в мягкой литографии. Кроме того, эта платформа также может быть расширен для других приложений с интеграцией других функциональных модулей, таких как градиент смеситель, поверхность рисунка, жидкость контроля и микроэлектрода.
The authors have nothing to disclose.
PAC частично поддержана NIH грант T32 Университета Висконсина стволовых клеток Training Program (PA Clark). JSK была частично поддержана опухоли Headrush Brain Research профессора, Роджер Loff Мемориал GBM исследовательского фонда, а фонд UW / Нейрохирургия Brain Research опухоли и образования Фонда. JCW и YH частично поддерживаются NIH грант NIBIB 1R01EB009103-01.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose | Gibco / Invitrogen | 11965 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Ham’s F12 | Gibco / Invitrogen | 31765 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
B27 supplement minus vitamin A | Gibco / Invitrogen | 12587-010 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Antibiotic-Antimycotic (PSA) | Gibco / Invitrogen | 15240 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0313 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant | Gibco / Invitrogen | PHG0021 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa | Sigma | H1027-250KU | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Laminin (natural mouse) | Gibco / Invitrogen | 23017-015 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Accutase | Millipore | SCR005 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
Stem cell medium |
|
||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin |
|
||
Epidermal Growth Factor (EGF) |
|
||
Heparin |
|
||
su-8 photoresist | MicroChem | ||
Silicon handle wafer | WRS Materials | 3P01-5SSP-INV | |
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
laminin | BD Bioscience | 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration | |
Biostation IM | Nikon instruments |